Очистка и активация тромбоцитов из цельной мышиной крови

Аннотация

Источник: Narciso, M. G., et al. Очищение тромбоцитов из крови мыши. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео мы описываем протокол очистки тромбоцитов из цельной крови мышей и их последующей активации тромбинистом тромбином. При анализе с помощью проточной цитометрии очищенные покоящиеся тромбоциты характеризуются на основе экспрессии их маркера клеточной поверхности CD41, в то время как очищенные активированные тромбоциты совместно экспрессируют оба поверхностных маркера CD41 и CD62P.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Очистка тромбоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистку тромбоцитов следует проводить при комнатной температуре, чтобы предотвратить их деградацию. Убедитесь, что температура реагентов и инструментов находится в диапазоне от 18 до 22 °C. Чтобы предотвратить деградацию тромбоцитов, следует избегать быстрого пипетирования и энергичного встряхивания во время процедуры.

1. Добавьте 600 μл градиентной среды иогексола (12% порошок йогексола в 0,85% натрия хлорида, 5 мМ трицина, pH 7,2) в 1,5 мл пробирки.
2. Медленно добавьте 200 μL образца крови вниз по стенке пробирки поверх градиентной среды с помощью наконечника пипетки с широким отверстием, чтобы кровь и иогексоловая среда не смешивались (Рисунок 1A).
3. Центрифугируйте пробирку, содержащую образец, при давлении 400 x g в течение 20 мин при 20 °C в качающемся роторе ковша с медленным ускорением и замедлением.
4. Соберите большую часть богатого тромбоцитами слоя и небольшую часть бедного тромбоцитами слоя (всего от 300 до 400 мкл) с помощью наконечника для дозатора с широким отверстием, не нарушая слои эритроцитов и лейкоцитов (рис. 1B). Перенесите образец тромбоцитов в новую пробирку.
   заметка: Если количество тромбоцитов в крови меньше или используется меньший объем крови, то богатый тромбоцитами слой и бедный тромбоцитами слой можно рассматривать как один слой.
5. Добавьте 1 мл PBS в образец тромбоцитов, перемешайте путем инвертирования и центрифугируйте при 800 x g в течение 10 мин при 20 °C в качающемся роторе ведра. Полностью выбросьте раствор и добавьте 200 μL PBS для ресуспендирования тромбоцитов с легким пипетированием.
   заметка: Этот шаг является необязательным, так как он удаляет градиентную среду и белки плазмы и повышает чувствительность тромбоцитов к агонистам, таким как тромбин. Поскольку разные центрифуги имеют разные программы, медленное ускорение/замедление можно определить, прочитав руководство пользователя центрифуги.
6. Переложите 30 мкл этого образца в новую пробирку для подсчета тромбоцитов. Оставшиеся тромбоциты могут быть использованы для биохимических и физиологических анализов, таких как активация тромбоцитов, агрегация, высвобождение гранул и т. д.
7. Для экстракции РНК или белка центрифугируйте образец тромбоцитов при давлении 800 x g в течение 10 минут, чтобы гранулировать тромбоциты. Полностью выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулы. Добавьте желаемый объем РНК или буфера для лизиса белка для лизиса тромбоцитов.

2. Активация тромбоцитов

1. В пробирку добавьте от 1 до 2 миллионов очищенных тромбоцитов в 100 μл окрашивающего буфера (PBS с 2% фетальной бычьей сывороткой, FBS).
2. Для получения множественного числа образцов приготовьте мастер-смесь антител с концентрацией 1 мкл (0,5 мг/мл) следующих антител: PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119, PE rat anti-mouse CD45, FITC ratc anti-mouse CD41 и APC rat anti-mouse/human CD62P (P-селектин) для обнаружения эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и активированных тромбоцитов соответственно. Добавьте мастер-смесь в пробирки для окрашивания ячеек. Не добавляйте тромбин.
3. В другую пробирку добавьте от 1 до 2 миллионов очищенных тромбоцитов в 100 мкл окрашивающего буфера и 0,4 мМ пептида GPRP. Добавьте тромбин для активации тромбоцитов и окрашивания клеток, следуя шагу 2.2.
   заметка: Перед добавлением тромбина в образец следует добавить GPRP, чтобы предотвратить образование агрегатов или тромбов в результате активации тромбоцитов. Концентрация тромбина должна быть оптимизирована для получения хорошей активации тромбоцитов. После активации тромбоцитов количество событий снижается во время сбора образцов с помощью проточной цитометрии.
4. В качестве положительного контроля добавьте 1 л цельной крови в буфер для окрашивания объемом до 100 мкл в пробирке и 0,4 мМ пептида GPRP. Добавьте тромбин для активации тромбоцитов. В качестве отрицательного контроля добавьте 1 мкл цельной крови в 100 мкл буфера для окрашивания. Не следует добавлять тромбин в отрицательный контрольный образец. Окрашивайте клетки, следуя шагу 2.2.
5. Для контроля изотипа проточной цитометрии пометьте 5 пробирок с неокрашенными, PE-Cy7, PE, FITC и APC. Добавьте 100 мкл окрашивающего буфера, 1 мкл крови и 1 мкл соответствующего антитела в меченые пробирки для окрашивания клеток.
6. Инкубировать образцы для окрашивания в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
7. Промойте образцы, добавив 1 мл буфера для окрашивания в каждую пробирку. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно выбросьте буфер для окрашивания, не выбивая гранулу.
8. Добавьте 300 мкл буфера для окрашивания в каждую пробирку, слегка перемешайте и переложите в пробирку FACS. Храните окрашенные образцы в темноте до анализа с помощью проточного цитометра.

Результаты

Рисунок 1. Кровь мышей до и после центрифугирования градиентной средой Iohexol. (А) Йогексол и кровь образуют два отдельных слоя перед центрифугированием, если образец крови добавлен осторожно. На левой панели отображается принципиальная схема, а на правой — собственно изображение. (В) Четыре отдельных слоя видны после центрифугирования цельной крови градиентной средой. На левой панели отображается ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
БТР крысиный противомышиный/человеческий CD62P (-селектин)	Теплонаучные	Тел.: 17-0626-82	Маркер активации тромбоцитов
Трубка Eppendorf	Научный центр Фишера	Тел.: 14-222-166	Пробирка для центрифуги
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Инвитроген	26140079	Ингредиент для окрашивания буфера
FITC крысиный антимышь CD41	BD Biosciences	553848	Маркер тромбоцитов
Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)	EMD Millipore	03-34-0001 (Английский	Предотвращение образования тромбоцитов
Наконечники для пипеток 1000 μл, широкоформатные	ThermoFisher Scientific	21-236-2С	Перенос образцов крови и тромбоцитов
Полиэтиленовая крыса антимышь CD45	BD Biosciences	561087	Маркер лейкоцитов
PE-Cy7 антимышиный TER 119	BD Biosciences	557853	Маркер эритроцитов
Наконечники для пипеток 200 μл, широкоформатные	ThermoFisher Scientific	21-236-1А	Перенос образцов крови и тромбоцитов
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	ThermoFisher Scientific	14040-117	Буфер для промывки и разбавления
Буфер для окрашивания	Внутри компании	Товар, не относящийся к каталогу	Буфер для промывки и разбавления
Тромбин	Лаборатория по исследованию ферментов	HT 1002a	Агонист активации тромбоцитов
Хлорид натрия	Сигма-Олдрич	С7653	Физиологический раствор
Настольная центрифуга	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	Центрифуга с ротором с качающимся ковшом
Трицин	Сигма-Олдрич	Т0377	Буфер для среды Nycodenz
Трубка FACS	Научный центр Фишера	352008	Пробирки для проточной цитометрии

)