Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление сред, растворов ферментов и животных
- Приготовьте 1% йоднодный спирт, растворив 1 г йода в 100 мл этанола.
- Приготовьте 2 500 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (PBS) без Ca+ и Mg2+ с добавлением 7,5 мл D-глюкозы (100 г/л) и 5 мл 100x стокового раствора пенициллина/стрептомицина (15 мг/мл D-глюкозы, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина финала).
- Дополните 1x 500 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 с 5 мл 100x Пенициллин/Стрептомицин стоковый раствор (50 ЕД/мл Пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина финала).
- Приготовьте раствор трипсин-ДНКазы I (2,5 мг/мл трипсина и 10 мкг/мл ДНКазы I), добавив 25 мг трипсина и 0,1 мл ДНКазы I (1 мг/мл ДНКазы I) к 9,9 мл PBS.
- Растворите 50 мг ингибитора трипсина в 5 мл PBS для раствора ингибитора трипсина А (10 мг/мл). Растворите 25 мг ингибитора трипсина в 10 мл PBS для раствора ингибитора трипсина B (2,5 мг/мл).
- Для раствора коллагеназы-гиалуронидазы-дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I) растворите 10 мг коллагеназы A (1 мг/мл в концелевом дозе), 10 мг гиалуронидазы (1 мг/мл в конечном итоге) и 0,1 мл DNase I (1 мг/мл DNase I) (10 мкг/мл в конечном количестве) в 10 мл PBS.
- Приготовьте раствор гиалуронидазы-ДНКазы I, добавив 10 мг гиалуронидазы (1 мг/мл в конце) и 0,1 мл раствора ДНКазы I (1 мг/мл) (10 мкг/мл в конце) до 9,9 мл PBS.
- Заказывайте крыс Вистар вовремя, чтобы в день выделения клеток Сертоли им было 19 дней.
заметка: Описанный протокол рассчитан на 10 крыс, но может быть модифицирован минимум для 5 и максимум для 20 крыс. Объемы всех решений должны быть соответствующим образом скорректированы.
В следующем протоколе «пипетка» означает серологическую пипетку.
2. Подготовка семенных канальцев
- Обезболите 10 самцов крыс Wistar одного за другим в эксикаторе с использованием CO2 и скорости потока, которая вытесняет не менее 20% объема камеры в минуту. Дождитесь, пока дыхание остановится, испытайте анестезию, сдавливая подушечку для ног, и если реакции нет, усыпьте каждую крысу по вывиху шейки матки. Слейте кровь, разрезав яремную вену и сонную артерию (влагалище и сонную артерию) под проточной водой. Продезинфицируйте брюшную полость, протерев ее 70% этанолом.
- С помощью щипцов приподнять кожу мышц живота и вырезать долю кожи овальной формы, которая простирается от лобкового симфиза до грудины (рисунок 1А), и взмахнуть ею вверх на грудную клетку. Далее захватите мышцы живота и сделайте медиальный разрез от лобкового симфиза до грудины.
- Сожмите живот большими пальцами от таза вверх для того, чтобы вытолкнуть семенники из нижнего таза. Подберите жировую подушку придатка яичка (рисунок 1B) с помощью щипцов для дальнейшего подтягивания яичка. Перережьте семенной канатик (Рисунок 1Б), оставив белочную оболочку нетронутой, и соберите все семенники по 20 мл PBS в коническую пробирку объемом 50 мл (Рисунок 1В).
- После сбора всех семенников продезинфицируйте их, добавив равный объем (20 мл) 1% (w/v) йода в этанол. Дважды переверните трубку и немедленно сцедите надосадочную жидкость. Быстро промойте яички дважды по 25 мл PBS каждый (Рисунок 1D).
- Переложите семенники в чашку Петри, содержащую 15 мл PBS (рис. 1E). Крепко обхватите каждое яичко щипцами на одном конце, сделайте небольшой надрез на белочной оболочке на противоположном конце и выдавите канальцы с помощью закрытых лезвий ножниц в качестве соскобительного инструмента.
заметка: Канальцы должны по-прежнему образовывать компактный пучок в форме яичка с несколькими канальцами, уходящими в раствор, чтобы обеспечить однородное ферментативное сбраживание (рис. 1F).
- Переложите декапсулированные яички во флакон с завинчивающейся крышкой объемом 100 мл, содержащий 10 мл раствора трипсин-ДНКазы I. Выполняйте пищеварение на водяной бане при температуре 32 °C (120 колебаний/мин). Через 4 мин оцените канальцы невооруженным глазом на предмет рассеивания канальцев. Как только канальцы начнут рассеиваться в растворе, немедленно остановите пищеварение. При необходимости продолжайте инкубацию до 2 мин.
- Остановите расщепление трипсина, добавив 5 мл раствора ингибитора трипсина А. Тщательно перемешайте раствор пипетированием вверх и вниз 3-4 раза с помощью пипетки объемом 10 мл и переложите его в коническую трубку объемом 50 мл.
- После 5 минут инкубации наблюдайте, как канальцы оседают под действием единичной силы тяжести, осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл из шага 2.6 и добавьте 10 мл раствора ингибитора трипсина В, чтобы полностью остановить расщепление трипсина. Восстановите канальцы путем пипетирования вверх и вниз 2-3 раза.
- С целью удаления загрязняющих интерстициальных клеток промывайте канальцы 9 раз по 25 мл PBS каждая. Суспендируйте канальцы при каждой промывке с помощью пипетки объемом 25 мл и дайте им осесть под действием единичного веса в течение 10 минут. Всегда используйте одну и ту же пипетку объемом 25 мл для пипетирования PBS, ресуспендирования и удаления надосадочной жидкости.
3. Удаление/изоляция перитубулярных клеток (ПТК)
- Переложите все трубочки во флакон объемом 100 мл с завинчивающейся крышкой и добавьте раствор коллагеназы-гиалуронидазы-ДНКазы I (рис. 2A). Выполняйте пищеварение в течение 10 минут на водяной бане при температуре 32 °C (120 колебаний/мин).
- Пипетируйте каплю суспензии на предметное стекло и быстро проверьте канальцы под микроскопом с инвертированным светом на предмет рутинной клеточной культуры при 100-кратном увеличении. Если пищеварение недостаточно развито, продолжайте инкубацию еще 2 мин (не считайте время, необходимое для микроскопической проверки). <бр/>
заметка: На этом этапе все канальцы укорачиваются по длине, а края канальцев должны стать шероховатыми (рис. 2В и В). Шероховатые края свидетельствуют о высвобождении перитубулярных клеток.
- Перенесите суспензию с переваренными канальцами в коническую трубку объемом 50 мл с помощью пипетки объемом 25 мл из шага 2.8. Вымойте флакон объемом 100 мл PBS 10 мл и добавьте его к трубочкам в конической трубке. Дайте переваренным канальцам осесть под действием единичной силы тяжести в течение 10 минут, осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, содержащую ПТС, с помощью пипетки объемом 25 мл и перенесите ее в новую коническую трубку. Для аспирации последних нескольких миллилитров используйте пипетку объемом 5 мл, чтобы предотвратить перенос канальцев.
4. Выделение клеток Сертоли (СК)
- Полностью суспензируйте осевшие канальцы из шага 3.3 в 25 мл PBS с помощью пипетки 25 мл и дайте им осесть под действием единицы силы тяжести в течение 12 мин. Используйте ту же пипетку 25 мл для пипетирования PBS, повторного суспендирования канальцев и удаления надосадочной жидкости. Повторите стирку 3 раза (всего 4 стирки).
- После последнего промывания переложите переваренные канальцы в другой флакон объемом 100 мл с завинчивающейся крышкой, содержащий раствор гиалуронидазы-ДНКазы I. Выполняйте пищеварение на водяной бане при температуре 32 °C (120 колебаний/мин).
- Через 5 минут снова проверьте канальцы с помощью светового микроскопического контроля при 100-кратном увеличении, как описано в шаге 3.2.
заметка: Должны быть видны короткие канальцы, трубчатые агрегаты и высвободившиеся клетки (Рисунок 2D).
- Дайте трубчатым агрегатам отстояться в течение 10 минут и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 25 мл. Промойте заполнители 4 раза, используя 25 мл PBS и время отстаивания 10 минут для каждого этапа промывки (Рисунок 2E).
- Добавьте 20 мл среды RPMI 1640 и пропустите суспензию 10 раз через иглу 18 G, установленную на шприце 20 мл. Избегайте образования пузырьков воздуха.
заметка: Втягивание суспензии внутрь и наружу через иглу считается одним проходом. Разрушение и гомогенизация клеток с помощью гидродинамического сдвига является стандартным методом подготовки клеток, которые имеют тенденцию к агрегации. Прохождение клеток через иглу для подкожных инъекций малого внутреннего диаметра вряд ли окажет влияние на их функциональные свойства. На рисунках 3C и D показана нормальная ультраструктура очищенных клеток Сертоли на 4-й день культивирования.
- Пипетируйте каплю суспензии на предметном стекле и быстро проверьте канальцы под микроскопом с инвертированным светом на предмет рутинной клеточной культуры при 10-кратном увеличении, если все агрегаты диспергированы (рис. 2F). Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр 70 мкм, чтобы получить чистую одноклеточную суспензию в фильтрате.
- Центрифугируйте фильтрат ступени 4.4 при 200 x g в течение 10 мин при RT без использования перерыва. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 25 мл и ресуспендируйте клетки Сертоли в среде 40 мл RPMI 1640 (без сыворотки).
- Смешайте 100 мкл клеточной суспензии со 100 мкл Trypan Blue Stain и подсчитайте клетки с помощью камеры Neubauer Improved. Отрегулируйте концентрацию клеток до 3 x 106 клеток/мл в соответствии с результатом подсчета. Семена по 1 мл на лунку на 6-луночной тарелке (=день 1). заметка: Клетки Сертоли в суспензии быстро оседают, поэтому пробирку следует кратковременно встряхивать каждый раз перед тем, как пипеткой будет взята аликвота клеток. До 4 дня они прочно прикрепляются к субстрату.
