$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выделение Vδ1 Т-клеток
- Возьмите <1 x 106 выделенных лимфоцитов для начального FACS, определяющего частоту Vδ1 CD4 T-клеток.
заметка: Размер популяции этой Т-клеточной единицы может сильно различаться у разных людей и в зависимости от их иммунологического состояния. Как правило, около 1% Т-клеток являются Vδ1+ и около 1-5% Vδ1+ клеток являются CD4+.
- Разбавьте клетки 1 мл буфера FACS, который состоит из PBS, содержащего 2% FCS и 5 мМ ЭДТА. Центрифугируйте при 660 х г в течение 2 мин и сцедите надосадочную жидкость. Объем рефлегмации около 100 мкл буфера FACS достаточен для последующего окрашивания. Кратковременно провести вихревую обработку и инкубировать клетки с 5 мкл Fc-блокирующего реагента в течение 5 мин при ЛТ для повышения специфичности окрашивания FACS.
- Добавляйте человеческие моноклональные антитела непосредственно в клетки, не удаляя Fc-блокирующий реагент. Обязательно окрашивайте клетки антителами против Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1:200), CD8 (1:200) и TCRαβ (1:25). Готовят контроль изотипа с соответствующими изотипами иммуноглобулинов. Инкубируйте клетки с антителами в течение 20 мин при 4 °C в темноте.
- Промойте клетки в буфере FACS объемом 1 мл (центрифуга в течение 2 мин; при 660 x g), сцедите надосадочную жидкость и приступайте к сбору FACS в оставшемся буферном объеме.
- Гранулируйте клетки (которые не используются в анализе FACS) путем центрифугирования в течение 12 мин; при 300 g; 8 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 60 мкл MACS-буфера на 1 x 107 клеток. Добавьте 20 μл Fc-блокирующего реагента на 1 x 107 клеток и инкубируйте в течение 5 минут при 4°C.
- Добавьте 10 мкл конъюгированного с FITC античеловеческого Vδ1 антитела из расчета 1 x 107 клеток непосредственно в клетки. Инкубировать в течение 12 минут при температуре 4 °C в темноте.
- Промойте клетки с использованием буфера MACS объемом 14 мл (центрифуга в течение 12 минут; при 300 г; 8 °C). Полностью отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в буфере MACS объемом 80 мкл на 1x107 клеток.
- Возьмите 1-2 x 105 ячеек и разведите их в 100 мкл буфера FACS для проверки мечения с помощью анализа FACS. Для этого этапа не требуется никаких дополнительных добавок. Убедитесь, что существует достаточная разница в яркости для элементов Vδ1- и Vδ1+. Если это не так, повторите шаги 1.3 и 1.4.
- Добавьте 20 мкл микрогранул анти-FITC на 1 x 107 клеток к остальным клеткам, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 15 мин в темноте при 4 °C. После этого промойте клетки, используя не менее 10 мл буфера MACS (центрифуга в течение 12 минут, при 300 x g; 8 °C).
- Во время центрифугирования уравновесьте предварительно охлажденную магнитную колонку, помещенную в магнит, с буфером MACS объемом 500 μл.
- Ресуспендируйте элементы в буфере MACS объемом 500 мкл (для номеров ячеек выше 1 x 108 соответственно увеличьте этот объем) и осторожно нанесите элементы на колонку. Соберите проточный канал, содержащий Vδ1-ячейки.
- Трижды промойте колонку буфером MACS объемом 500 мкл и снова соберите проточный поток в той же пробирке. Обратите внимание, что резервуар должен быть пустым перед применением буфера к колонне.
- Снимите колонку с магнитного устройства и поместите ее в коническую трубку объемом 15 мл. Быстро промойте колонку буфером MACS объемом 1 мл, сильно вдавливая поршень в колонку. Соберите элюат в пробирку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того чтобы получить чистоту >98%, обычно необходимо повторить шаги 1.7-1.9 со вторым столбцом.
- Проверьте чистоту клеток с помощью анализа FACS с той же панелью антител, что и ранее (см. 1.1.2), и подсчитайте количество клеток.
2. Выделение Vδ1CD4+ Т-клеток
- Ресуспендировать 25 мкл гранул CD4 с помощью вихря на >30 сек. Промойте шарики (минимальное количество, указанное производителем) в буфере MACS объемом 1 мл в реакционной пробирке объемом 1,5 мл, поместив пробирку в магнит на 1 мин. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки небольшого размера (200 мкл) и повторно суспендируйте гранулы в исходном объеме буфера MACS.
- Гранулируйте Vδ1+ клетки (центрифугируйте в течение 12 мин; при 300 x g) и аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте все Vδ1+ клетки в буфере MACS объемом 500 мкл и добавьте их в пробирку, содержащую гранулы. Энергично перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 4 °C при постоянном наклоне (например, в ротаторе).
- Поместите трубку с элементами в магнит на 2 мин. Убедитесь, что в крышке нет остатков.
ПРИМЕЧАНИЕ: CD4+ клетки связывают магнитные шарики и прикрепляются к той стороне трубки, которая обращена к магниту.
- Осторожно откройте крышку, держа трубку внутри магнитного устройства, и соберите надосадочную жидкость, содержащую клетки CD4-Vδ1+, с помощью пипетки небольшого размера. Поместите клетки CD4-Vδ1+ в отдельную пробирку и снова поместите эту пробирку в магнит, чтобы избежать возможного попадания клеток CD4 или шариков из популяции.
- Промойте CD4-клетки в буфере MACS объемом 5 мл (центрифуга в течение 12 мин; при 300 x g) и повторно суспендируйте их в концентрации 1 x 105 клеток на 100 μл среды. CD4-клетки можно легко культивировать в подходящих условиях.
- Поместите трубку с мишенями для клеток CD4+ за пределы магнитного поля, повторно суспендируйте элементы в буфере MACS объемом 500 мкл и поместите их обратно в магнитное устройство. Повторите шаги 2.3-2.5 дважды для получения более высокой чистоты. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования.
- Ресуспендируйте CD4+ клетки в 100 мкл питательных сред (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L-глутамин, 1 % пенициллин/стрептомицин) и добавьте 10 л раствора, отделяющего гранулы. Инкубировать при ОТ в течение 45 мин при постоянном наклоне (например, во вращателе).
- Поместите клетки в магнит на 1 мин. Осторожно соберите надосадочную жидкость, содержащую не содержащие гранул Vδ1+CD4+, с помощью небольшой пипетки.
- Снаружи магнита ресуспендируйте гранулы питательной средой объемом 100 мкл и повторите шаги 2.6 и 2.7 дважды, чтобы получить большее количество клеток CD4+.
- Гранулируйте клетки (центрифуга при 300 x g, в течение 12 минут) и полностью отбракуйте надосадочную жидкость путем пипетирования. Ресуспендируйте клетки в свежую, предварительно подогретую среду и подсчитайте их. Исследуйте чистоту клеток Vδ1+CD4+ с помощью анализа FACS, показанного на этапах 1.1.1-1.1.3.