Метод in vitro для создания внеклеточных ловушек нейтрофилов человека

Аннотация

Источник: Najmeh, S., et al. Упрощенное выделение и обращение с внеклеточными ловушками нейтрофилов человека (НВЛ). J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует метод in vitro для создания и изоляции внеклеточных ловушек нейтрофилов (НЭО). Нейтрофилы выделяются из периферической крови и стимулируются форболмиристатацетатом (ФМА) для производства НВЛ. Во время инкубации нейтрофилы подвергаются процессу клеточной смерти (NETosis) для высвобождения НВЛ, содержащих деконденсированный хроматин, смешанный с гранулированными цитоплазматическими белками.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Генерация НЭО

1. Стимулируйте нейтрофилы 500 нМ PMA (на 30 мл раствора нейтрофилов) и инкубируйте на плоской чашке для культуры тканей размером 150 x 25 мм с сеткой 20 мм в течение 4 часов при 37 °C 5%_CO2. Это позволит NETosis.
2. После 4 ч стимуляции осторожно аспирируйте и отбросьте среду, оставив слой НВЛ и нейтрофилов, прилипший внизу. Не нарушайте этот слой.
3. Используя в общей сложности 15 мл холодного PBS без Ca и Mg на блюдо, вымойте дно каждой посуды, пипетируя 15 мл PBS на дно посуды, чтобы оторвать весь прилипший материал со дна.
4. Соберите раствор, полученный при мытье каждой посуды (шаг 1.3), в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 10 минут при 450 x g при 4 °C. Нейтрофилы и любые оставшиеся клетки будут гранулироваться на дне, оставляя бесклеточную надосадочную жидкость, богатую НВЛ.
5. Разделите надосадочную жидкость на микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и вращайте в течение 10 минут при 18 000 x g при 4 °C. Это позволит всей ДНК гранулироваться.
   заметка: Центрифугирование в больших пробирках проще и менее трудоемко, если такие высокие скорости достижимы на обычной центрифуге, в противном случае потребуется разделить надосадочную жидкость на меньшие пробирки, чтобы использовать высокоскоростную микроцентрифугу
.
6. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать все гранулы, полученные вместе, в ледяном PBS до концентрации, соответствующей 2 x 10⁷ нейтрофилов на 100 мкл PBS. Это позволит получить бесклеточный запас НВЛ, который можно использовать для последующих экспериментов.
7. Измерьте концентрацию ДНК в полученном образце с помощью спектрофотометрии или альтернативного инструмента количественного определения ДНК. Адекватная концентрация в образце должна находиться в диапазоне от 140 до 180 нг/мкл.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевой буфер (PBS) Дульбекко, модифицированный, без хлорида кальция и хлорида магния	зубр	311-425-CL
RPMI-1640 Среда с L-глютамином	зубр	350-000-КЛ	3% раствор RPMI получают путем дополнения RPMI 3% сывороткой плода крупного рогатого скота
Форбол 12-миристат 13-ацетат (ПМА)	Сигма-Алрдрич	П8139
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	зубр	080-150
Чашка для культуры тканей Integrid с сеткой 20 мм (150 x 25 мм)	сокол	353025