Выделение иммунной клеточной сети десны из блоков зубов мышей

Аннотация

Источник: Dutzan, N. et al., Выделение, характеристика и функциональное исследование иммунной клеточной сети десны. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует процедуру выделения сети иммунных клеток десны из мышиной модели. Ферментативное сбраживание высвобождает десневую ткань из прикрепленных зубов и кости, которая в дальнейшем механически переваривается, высвобождая иммунные клетки из десны. Выделенные клетки готовы к проведению иммунологических экспериментов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовьтесь заранее

1. Готовьте полнорационные среды: RPMI с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% FBS.
2. Приготовьте среду ДНКазы: 50 мл среды RPMI с добавлением 7,5 г ДНКазы (Сделайте свежей, всегда держите на льду).
3. Приготовьте среду для коллагеназы-ДНКазы: 5 мл среды ДНКазы плюс 3,2 мг/мл коллагеназы IV типа (готовьте в свежем виде, всегда держите на льду).
4. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C.
5. Нагрейте шейкер инкубатора до 37 °C.

2. Выделение, рассечение и выделение клеток из десневых блоков

1. Усыпляйте мышей, подвергая их воздействию_CO2 в соответствующей камере, в соответствии с рекомендациями Консультативного комитета по исследованиям животных (ARAC).
2. Откройте грудную и брюшную полость, чтобы обнажить сердце и внутренние органы. Для перфузии необходимо сделать надрез в нижней полой вене и ввести 3 мл PBS через левый желудочек с помощью шприца объемом 3 мл с иглой 27 G.
3. Обездвижите тело и голову мыши на коврике животом вверх.
4. Разрежьте ножницами каждую спайку губы по направлению к шее, отделяя кожу, покрывающую нижнюю челюсть и область шеи, и обнажая нижележащие ткани и мышцы. Рассеките нижнюю губу, чтобы обнажить нижнюю челюсть.
5. Разрежьте между нижними резцами, чтобы отделить обе стороны нижней челюсти, и иммобилизуйте каждую сторону, чтобы получить доступ к ротовой полости.
6. Визуализируйте и рассекайте нёбо вдали от носовой полости.
7. Рассекайте участки с помощью 10-лепесткового аппарата и включайте в себя области верхнечелюстных и нижнечелюстных моляров с окружающей десной (Рисунок 1). Сделайте вертикальные разрезы прямо перед первым моляром и позади третьего моляра, а также горизонтальный разрез на границе десны (белый воротник ткани, окружающий зубы).
8. Поместите верхнечелюстные и нижнечелюстные блоки в коническую пробирку объемом 50 мл с 5 мл коллагеназы/ДНКазы (держите на льду).
9. Инкубировать в шейкерном инкубаторе при температуре 37°C в течение 1 часа и в течение последних 5 минут инкубации добавить 50 мкл 0,5 М ЭДТА.
10. Добавьте 5 мл холодных ДНКазных сред в пробирку с салфетками объемом 50 мл и аккуратно перемешайте.
11. Перенесите 4 блока ткани в чашку Петри и накройте их 500 мкл ДНКазной среды. Удалите десну из каждого блока ткани, используя лезвие скальпеля и направив лезвие в десневую и межзубную области.
12. Перенесите ткани и среду из чашки Петри, а также предыдущую среду ДНКазы, использованную во время диссекции, в новую пробирку объемом 50 мл через клеточное сетчатое фильтр (размер 70 мкм). Промойте с помощью ДНКазных сред (3-5 мл) все используемые инструменты и профильтруйте.
13. С помощью поршня стерильного шприца объемом 3 мл разомните ткань о ситечко, процедив холодными средами ДНКазы (от 30 до 35 мл).
14. Промойте сетчатый фильтр холодной ДНКазной средой.
15. Центрифуга при 4 °C, 314 x g в течение 6 мин.
16. Выбросьте надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте ее в 1 мл готовой среды.
17. Подсчитайте ячейки (ожидаемое количество должно находиться в диапазоне от 8 x 10⁵ до 1,2 x 10⁶ клеток с жизнеспособностью >80%) с помощью автоматического счетчика ячеек.

Результаты

Рисунок 1: Выделение мышиной десны. Иллюстрация, демонстрирующая границы диссекции в верхней челюсти и изолированном десневом сегменте, которые будут использоваться для диссекции десневой ткани. (В) Сегмент мышиной верхней челюсти (молярная область) с контуром для блочной диссекции и изолированный блок. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) верхнечелюстного молярного сегмента с очерченными десневыми тканями показано в низко...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тонкие ножницы	Инструменты для изобразительной науки	14058-11
Рукоятка скальпеля #3	Инструменты для изобразительной науки	10003-12
Лезвия скальпеля #10	Инструменты для изобразительной науки	10010-00	стерильный
Щипцы от осколков	Интегра Милтекс	6-304
Иглы с правильным скосом	BD Медицина	305109	27G, длина 12,7 мм
Моноджектовые шприцы	Ковидьен	8881513934	Наконечник для замка Люэра, 3 мл
PBS, pH 7,4	Технологии Life	10010-049 (Английский)	Без кальция и магния
РПМИ 1640	Лонза	12-167Ф	Без L-глютамина
ДНКаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота	Сигма-Олдрич	ДН25-1Г
Коллагеназа IV типа	Gibco (от Life technologies)	17104-019
Фетальная бычья сыворотка	Биопродукты Gemini	100-106
Гентамицин 50 мг/мл	Качественное биологическое	120-098-661ЕА
Стрептококк	Gibco (от Life technologies)	15140-122
L-глютамин	Gibco (от Life technologies)	No 25030-081
0,5 м ЭДТА pH 8,0	Качественное биологическое	351-027-721ЕА
Пробирки 50 мл	Корнинг	No 352070 (Английский	Полипропилен, стерильный
Клеточные сетчатые фильтры 70 мкМ	Корнинг	No 352350 (Английский
Чашки Петри	Корнинг	351029	стерильный

) )