$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Образцы легочной ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований легочной ткани in vivo, изучайте образцы после соответствующего воздействия. Наиболее актуальным для данного эксперимента является воздействие на инфекционные микроорганизмы, в частности бактерии. Для этого метода можно использовать следующие линии мышей C57BL/6 или BALB/c, возрастом 10 - 12 недель, весом 25 - 30 г, и самцы.
- Усыпьте мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (400 мг/кг) и ксилазина (40 мг/кг). Откройте грудную полость и обнажите легкие и сердце с помощью хирургических щипцов и ножниц.
- Введите теплый PBS с помощью иглы 21 калибра в правый желудочек, чтобы вымыть кровь из сосудов в течение 30 с, затем введите 10 мл 2% фиксатора PLP в течение 30 с (в правый желудочек).
- Используйте теплую PBS (42 °C) для промывания открытой грудной полости. Интубируйте трахею иглой 21 калибра и отрезком трубки 0,8 мм, отрезанным по размеру, и введите 800 мкл предварительно подогретого (до 42 °С) 3% раствора агарозы с низкой температурой плавления.
- Перевяжите трахею плетеным шелком (4,0 USP). Поместите нить вокруг трахеи, чуть ниже точки введения канюли, и закрепите ее с помощью простого верхнего узла. Чтобы затвердеть агарозу, введите ледяной PBS вокруг легких. Удалите легкие и сердце в виде блока из грудной полости с помощью ножниц и тупого вскрытия. Удалите каждое легкое по отдельности, а затем зафиксируйте их на 16 ч в 2% PLP или формалине при 4 °C.
- Храните образцы в PBS при температуре 4 °C до разрезания тканей.
- Для подготовки образцов легочной ткани используйте следующие этапы.
- Зафиксировать легочные ткани (резецированные на шаге 1.1) в 10% натуральном буферизованном формалине в течение 24 ч при комнатной температуре. Переведите на 75% этанол и поместите в тканевый процессор на 12-часовой цикл (2,5 часа в 75% этиловой кислоте, 3 часа в абсолютной этиловой кислоте, 3,5 часа в растворителе 3B и 3 часа в парафине).
- Встраивание в стандартный парафин для создания фиксированных формалином и залитых парафином блоков (FFPE), которые хранятся при комнатной температуре.
заметка: На этом этапе вообще удобно вырезать легкие срезы для стандартных слайдов.
- Вырежьте срезы легких FFPE толщиной 4 - 5 мкм с помощью микротома и закрепите их на заряженных предметных стеклах с покрытием.
- Чтобы установить слайды, нанесите 3 капли монтажного материала на покровные стекла размером 60 мм x 24 мм (размер 1,5), переверните слайд на покровном стекле и вытолкните лишнюю среду. Герметично запечатайте их лаком для ногтей и храните при комнатной температуре.
2. Подготовка/микроскопия образцов легочной ткани
- Для удаления воска, регидратации и предварительной обработки образца легочной ткани FFPE раствором для извлечения антигена.
- Высушите горки FFPE в духовке в течение 60 минут при температуре 60 °C. Затем поместите предметные стекла в раствор ксилола на 30 минут и переведите в 70% раствор этанола на 5 минут при комнатной температуре. Промойте в водопроводной воде.
- Поместить в термонепроницаемую полиэтиленовую пленку и подвергнуть извлечению антигена HIER в скороварке на 10 минут при 10 м/моль/л Tris, 1 ммоль/ЭДТА pH 9,0. Остудить в течение 20 минут. Два раза промыть в водопроводной воде в течение 5 минут на коромысле, затем один раз с PBS на коромысле.
- Смешайте с 10% куриной сывороткой в 5% BSA/PBS на 30 минут при комнатной температуре.
- Испачкайте ткань.
- Чтобы определить МЕТ в макрофагах, добавьте первичные антитела (MMP-9, H3Cit и F4/80) в 1% BSA/PBS в течение 16 ч при 4 °C при разведении 1/100 (конкретные сведения о количествах антител приведены в таблице материалов). Постирайте два раза PBS в течение 5 минут на коромысле.
- Обеспечьте флуоресцентное обнаружение путем инкубации с соответствующими вторичными антителами в 1% BSA/PBS в течение 40 минут при комнатной температуре. Антителами: (1) куриный анти-мышиный 488 (зеленый), (2) куриный антикозий 594 (красный) и (3) ослиный антимышиный 647 (дальний красный).
- Промойте секции в PBS и установите на них монтажный материал, содержащий DAPI, для окрашивания хроматином.
- Получение флуоресцентных изображений с помощью конфокальной лазерной сканирующей головки, прикрепленной к инвертированному микроскопу.
- Возбуждайте подготовку с помощью лазеров с длиной волны 405, 488, 561 и 647 нм. Захватывайте изображения в одной плоскости размером 512 x 512 пикселей, нажимая кнопку последовательного выравнивания (усреднение на 2 строки) с использованием воздушных объективов 20X 0.1 NA и масляных объективов 40X 1.0 NA.
- Получите не менее десяти полей зрения на участок для анализа и данные для каждого результата (т.е. 10 полей зрения высокой мощности (HFOV) для контроля, 10 для стимулируемого образца и т.д. для каждой мыши).
заметка: Для получения репрезентативной выборки всего поля может быть использована матричная система, в которой поле разделено на различные разделы, и для каждого отдельного образца одна и та же матрица используется для выбора полей обзора (например, поле может быть разделено на 9 разделов, а от центра и 4 углов - на 9 участков, снимаются два HFOV).