Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический поток метода описан на рисунке 1.
1. Подготовка материала
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте все реактивы асептически в стерильном колпаке и храните при указанной температуре. Реагенты могут храниться до 2 лет, не теряя своего эффекта.
- Приготовьте ЦФА, содержащую 20 мг/мл Mycobacterium tuberculosis, как описано ниже.
- Добавьте 100 мг сублимированного M. tuberculosis H37RA (см. Таблицу материалов) и пять стальных шариков диаметром 3,2 мм в пробирку объемом 7 мл (см. Таблицу материалов). Встряхните трубку в гомогенизаторе (см. Таблицу материалов) в течение 60 с при максимальной скорости (5 000 об/мин).
- Добавьте в пробирку 5 мл неполного адъюванта Фрейнда (ИФА) и снова встряхивайте в течение 60 с на максимальной скорости. Переложите суспензию гомогенизированной M. tuberculosis в IFA (теперь называется CFA) в свежую пробирку с помощью пипетки, оставив гранулы, и храните при температуре 4 °C до использования.
- Добавьте сверхчистую воду в лиофилизированный порошок пептида MOG35-55 (см. Таблицу материалов) для получения конечной концентрации пептида 10 мг/мл. Стерилизуйте раствор, пропустив его через фильтр 0,2 мкм. Приготовьте 60 μл аликвот и храните при температуре -20 °C до использования.
заметка: Пептид MOG35-55, используемый в этом эксперименте, имеет иммуноконцевую чистоту (~70%), расщеплен TFA, легко растворяется в воде и содержит С-концевой амид (-NH2) для повышения стабильности in vivo. Пептидные аликвоты никогда не размораживались и не замораживались повторно более двух раз и хранились при температуре -20 °C до использования.
2. Приготовление CFA/пептидных эмульсий
- Рассчитайте количество эмульсии, необходимое для иммунизации. В этом стандартном протоколе каждая мышь получает 50 г пептида MOG35-55 и 300 г M. tuberculosis, диспергированных в адъюванте Фрейнда (CFA). Количество каждого реагента (пептид MOG35-55, PBS, CFA и IFA), необходимое для приготовления эмульсий, можно рассчитать с помощью Дополнительного файла 1. Дополнительные 20% всех реагентов, чтобы компенсировать небольшие потери эмульсии, включаются в расчет.
заметка: Коммерческий набор эмульсии (см. Таблицу материалов), используемый в этом исследовании, состоит из трубки, завинчивающейся крышки и поршня в стерилизованном пакете. Каждая пробирка набора эмульсии вмещает максимум 9,6 мл, что позволяет приготовить 8 шприцев по 1 мл, достаточных для иммунизации 40 мышей (или 80 мышей при использовании 100 мкл эмульсии на одно животное).
- Поместите на лед пробирку с завинчивающейся крышкой (из коммерческого набора эмульсий) и реагенты, которые будут использоваться.
- Добавьте компоненты эмульсии в следующем порядке в объемах, рассчитанных на шаге 2.1: PBS, затем пептид, затем M. tuberculosis в CFA и, наконец, IFA.
- Плотно закройте трубку колпачком, затянув и ослабив ее несколько раз. Энергично встряхивайте пробирку вручную в течение 5-10 с, чтобы предварительно перемешать реагенты.
- Поместите трубку в встряхивающий гомогенизатор и закрепите ее стержнем. Установите максимальную скорость и время на 60 с. Как только пробежка будет завершена, поместите трубку на лед на 3 минуты. Повторите прогон еще один или два раза с теми же настройками.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 300 x g в течение 1 минуты, чтобы удалить захваченный воздух и уплотнить эмульсию.
- Снимите колпачок с трубки, вставьте поршень в трубку и медленно нажмите на него, пока он не достигнет верха эмульсии. Снимите защелкивающуюся застежку на дне трубки, повернув ее.
- Извлеките поршень из инъекционного шприца (1 мл; см. Таблицу материалов). Добавьте иглу (лучше 25-27 г) в инъекционный шприц.
- Прикрепите задний конец инъекционного шприца к специальному замку в нижней части трубки и зафиксируйте его коротким поворотом.
- Перенесите эмульсию из трубки в инъекционный шприц, слегка надавливая на поршень. Остановите при достижении эмульсией градуировки 0,15 мл инъекционного шприца.
- Отделите инъекционный шприц от трубки и осторожно вставьте поршень, следя за тем, чтобы воздух не попал внутрь шприца. Нажимайте на поршень до тех пор, пока эмульсия не выйдет из иглы.
заметка: На этом этапе часть эмульсии может быть использована для контроля качества (см. шаг 3).
- Повторите шаги 2.8-2.11 для остальной эмульсии, присутствующей в пробирке.
заметка: Чтобы свести к минимуму отходы дорогостоящих эмульсий CFA/антигенов, следует использовать шприцы объемом 1 мл. Можно использовать другие шприцы, которые подходят к специальному замку на дне трубки; Тем не менее, может потребоваться приготовление большего объема эмульсии. Пептидная эмульсия CFA/MOG35-55 может храниться при температуре 4 °C до 15 недель без потери своей способности, индуцирующей EAE.
3. Контроль качества эмульсии
- Дроп-тест: Добавьте небольшую каплю эмульсии в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл, наполненную 20 мл холодной воды. Закройте тюбик и встряхните его рукой в течение пары секунд. Появление мельчайших отчетливых капель подтверждает образование водно-масляной эмульсии.
- Исследуйте эмульсию с помощью фазово-контрастной микроскопии.
- Чтобы проанализировать размер частиц воды в масле, добавьте крошечную каплю (2-3 мкл) эмульсии на предметное стекло микроскопа, размажьте ее защитным стеклом, а затем сильно надавите круговыми движениями, чтобы эмульсия разровнялась.
- Рассмотрите размазанную эмульсию под фазово-контрастным микроскопом (см. Таблицу материалов) с 400-кратным увеличением и сфокусируйтесь на поле с монослоем эмульсии. Убедитесь, что видны мелкие однородные частицы серого/белого цвета (Рисунок 2A).
