Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура, включая подготовку животных и хирургическое вмешательство, займет 30–40 мин. Перед операцией включите микроскоп и прогрейте закрытый инкубатор на микроскопе до 37 °C.
- Провести эксперименты на мышах TcrdEGFP в возрасте 8–10 недель на фоне C57BL/6, полученных от Bernard Malissen (INSERM, Париж, Франция). В соответствии с процедурой, одобренной IACUC, обезболивайте мышь путем внутримышечного введения кетамина (120 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) в зависимости от веса животного. Оценивайте уровень анестезии по частоте дыхания (55–65 вдохов в минуту), защемлению пальцев ног и глазному рефлексу.
- Как только будет достигнута анестезия в хирургической плоскости, закрепите задние лапы мыши с помощью ленты на грелке для поддержания температуры тела, которую можно контролировать с помощью ректального термометра. Если есть признаки того, что анестезия ослабевает (например, учащенное дыхание, моргание и/или реакция глазных мышц на глазной рефлекс), повторно вводите 50 мкл кетамина/ксилазина за один раз до тех пор, пока мышь не будет полностью седативирована.
- Приготовьте ядерный краситель путем разбавления 50 мкл Hoechst 33342 (10 мг/мл) с 315 мкл 0,9% физиологического раствора; конечная концентрация составляет 37,5 мг/кг в зависимости от веса мыши (приблизительный объем 200 мкл). После того, как мышь будет обезболива, медленно введите Hoechst с помощью туберкулинового шприца через ретроорбитальный венозный синус.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите 1–2 минуты, прежде чем переходить к следующему шагу, чтобы позволить мыши акклиматизироваться к изменению циркулирующего объема после ретроорбитальной инъекции.
- Нанесите небольшое количество смазки на глаза, чтобы предотвратить их высыхание.
2. Хирургия мышей: лапаротомия для обнажения слизистой оболочки кишечника
- Сделайте вертикальный разрез длиной 2 см через кожу и брюшину по средней линии нижней части живота для экстернализации области кишечника, подлежащей визуализации.
- С помощью угловых щипцов осторожно вытащите слепую кишку из брюшинной полости и определите область тонкой кишки, которую необходимо изобразить. Будьте осторожны, чтобы не разорвать брыжеечные кровеносные сосуды во время этого процесса. Чтобы свести к минимуму потенциальное повреждение или кровотечение, избегайте захвата или защемления кишечника щипцами.
- Найдите подходящий участок тонкой кишки (2–3 см) для визуализации, который содержит минимальное содержание кала. Осторожно верните слепую кишку и оставшуюся тонкую кишку в брюшную полость, при этом исследуемый сегмент вынесите наружу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прокола слепой кишки или нарушения брыжеечной сосудистой сети на этом этапе.
- Поместите две пары щипцов по обе стороны от подлежащей брыжейки между кровеносными сосудами и осторожно потрите кончики щипцов друг о друга, чтобы создать отверстие в мембране (Рисунок 1). Это позволит игле пройти через брыжейку при закрытии брюшинной полости под кишечником.
- Закройте разрез, сохраняя петлю кишечника наружной. С помощью угловых щипцов и изогнутой иглы с коническим концом, прикрепленной к 5-сантиметровому шву, проникнуть в одну сторону брюшины, пройти через отверстие, сделанное на предыдущем этапе, и вверх через другую сторону перитонеальной слизистой оболочки. Наложите один шов вверху, а другой — в нижнюю часть разреза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не повреждайте сосудистую сеть во время этого этапа.
- Повторите этот процесс, чтобы закрыть кожу под петлей кишечника, наложив один шов в середине разреза, между предыдущими швами в нижележащей брюшине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно экстернализировать только ту область, которая должна быть изображена; Это уменьшит количество посторонних движений во время визуализации. Обязательно избегайте перевязывания брыжеечных артерий.
- С помощью электрокаутеризации сделайте линию перфорации вдоль противобрыжеечной границы. Сразу после прижигания нанесите несколько капель воды на поверхность кишечника, чтобы предотвратить дополнительное повреждение тканей, вызванное теплом. Промокните салфеткой Kimwipe, чтобы удалить остатки воды.
- С помощью ножниц Vannas вырежьте небольшой горизонтальный разрез на дистальном крае прижигаемой ткани и продолжайте резать по длине прижигаемой линии по направлению к проксимальному концу сегмента наружной ткани (примерно 1,5 см в длину), чтобы обнажить поверхность слизистой.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости с помощью щипцов аккуратно удалите излишки кала, оставшиеся на открытой поверхности слизистой оболочки.
- Накройте брюшную полость мыши влажным салфеткой Kimwipe, чтобы предотвратить обезвоживание тканей. Транспортируйте мышь к микроскопу в закрытом сосуде.
3. Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии с вращающимся диском
- Нанесите пипетку объемом 150 мкл 1 мкМ AlexaFluor 633 in HBSS на стеклянное дно чашки диаметром 35 мм. Расположите мышь так, чтобы открытая поверхность слизистой непосредственно соприкасалась с покровным стеклом.
- Наклоните головку микроскопа назад и поместите мышь на закрытую чашку на предметном столике в предварительно нагретом инкубаторе. В качестве альтернативы накройте мышь нагревательным одеялом для поддержания температуры тела.
- Запустите программное обеспечение для работы с образами. Интенсивность возбуждения и время экспозиции для каждого лазера не должны превышать 10–15 мВт или 120–150 мс соответственно, чтобы избежать фотообесцвечивания и минимизировать интервал между временными точками. Установите среднее значение кадра на «2» и включите функцию усиления ЭМ для уменьшения фонового шума. Выберите 63-кратную калибровку объектива, чтобы обеспечить правильное измерение размера пикселя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные выше настройки предназначены для обеспечения исходного ориентира, но будут варьироваться в зависимости от индивидуальной конфигурации микроскопа.
- Используя лазер с длиной волны волны 405 нм и воздушный объектив с 20-кратным увеличением, визуализируйте ядра, чтобы определить поле ворсинок, которые не имеют заметного движения или дрейфуют на глаз. Избегайте областей искусственного движения из-за дыхания, перистальтики или сердцебиения.
- С помощью сканирования XY запишите координату XY интересующего поля и переключитесь на объектив погружения в глицерин 63X.
- Убедитесь, что ворсинки в выбранном поле стабильны, получив изображение в реальном времени на канале 405 нм в течение 1 минуты.
- Во время получения изображения в реальном времени на канале 405 нм отрегулируйте фокус так, чтобы найти ортогональную плоскость непосредственно под ворсинчатым кончиком. Приобретайте Z-стеки, начиная чуть ниже эпителия ворсинчатого кончика вниз по ворсинкам до тех пор, пока не станет трудно растворить ядра, около 15–20 мкм, с шагом 1,5 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: При визуализации с тремя каналами (405, 488, 640 нм) с использованием описанных выше времен экспозиции можно получить все три канала последовательно с интервалом примерно 20 с.
- Откройте программное обеспечение в режиме анализа через 3–5 минут после начала съемки, чтобы подтвердить стабильность изображения и подвижность γδ IEL. Продолжайте получать изображения в течение 30–60 минут для каждого поля ворсинок. Запишите по 2–3 поля для каждой мыши. Во время визуализации следите за мышью каждые 5 минут.
