$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Производство и определение характеристик LMP
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить загрязнение, убедитесь, что все материалы, используемые в этом эксперименте, стерильны или автоклавированы. Выполняйте все действия в RT в шкафу биологической безопасности в стерильных условиях, если не указано иное.
- Стимуляция и сбор МП
- Разморозьте аликвоту из 10 миллионов Т-клеток CEM на водяной бане при температуре 37 °C. Разведите в 10 мл предварительно подогретую сыворотку кроветворную среду типа X-VIVO, в стерильной пробирке объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 г х 5 мин. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в предварительно подогретой среде объемом 5 мл.
- Перенесите клетки в колбу для культуры тканей T75 (для суспензионных клеток) с 15 мл предварительно подогретой гемопоэтической среды, такой как X-VIVO, и инкубируйте в течение 4 дней во влажном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2.
- Через 4 дня переложите всю питательную среду и клетки в колбу для культуры тканей T175, содержащую 100 мл свежей среды. Продолжайте инкубацию клеток в течение примерно 72 часов в тех же условиях, пока они не вырастут до плотности 2 миллиона клеток/мл.
- Равномерно разделите клетки между четырьмя колбами T175, каждая из которых содержит 150 мл свежей среды, и продолжайте культивирование клеток до тех пор, пока клетки не вырастут (примерно 48 часов инкубации) до плотности 2 миллиона/мл.
- Соберите клетки из каждой колбы путем центрифугирования при 200 x g в течение 5 минут и повторно суспендируйте 300 x 106 клеток в новую колбу T175, содержащую 150 мл свежей среды, для поддержания плотности клеток 2 миллиона/мл.
- Добавить актиномицин D (растворенный в ДМСО в концентрации 2 мг/мл) в среду в конечной концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировать в течение 24 ч.
- Перелейте всю питательную среду в конические пробирки объемом 50 мл и раскрутите клетки при 750 x g в течение 5 мин. Перенесите надосадочную жидкость в конические пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при 1500 x g в течение 15 мин для удаления крупных фрагментов клеток.
- Перелейте надосадочную жидкость во флакон объемом 250 мл и ультрацентрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 50 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и соберите гранулы.
- Промойте гранулы, обогащенные LMP, 40 мл стерильного PBS в пробирке объемом 50 мл центрифугированием при 12 000 x g в течение 50 мин. Повторите этот шаг дважды.
- Соберите последнюю надосадочную жидкость для стирки, она будет использоваться в качестве контроля автомобиля. Суспендируйте гранулы LMP в 1 мл PBS и перенесите их в стерильную микропробирку объемом 1,5 мл. Аликвотируйте и храните изолированные LMP при температуре -80 °C (чтобы избежать многократных циклов свободного оттаивания).