$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Обогащение антиген-специфичных CD8+ Т-клеток приготовленными искусственными антигенпрезентирующими клетками с наночастицами.
- Выделите CD8+ Т-клетки.
- Усыпляют животных путем воздействия изофлурана с последующим вывихом шейки матки.
- Удалите селезенку и лимфатические узлы у мышей дикого типа C57BL/6j и поместите их в раствор PBS. Мацерируйте органы и элуируйте клетки через стерильный клеточный фильтр размером 70 мкм с частыми промывками PBS.
- Чтобы удалить не-CD8+ Т-клетки, используйте бесконтактный набор для изоляции CD8+ Т-клеток и следуйте инструкциям производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого антигенного состояния требуется не менее 3 x 106 CD8+ Т-клеток.
- Добавьте наночастицы aAPC для связывания с CD8+ Т-клетками.
- После выделения сконцентрировать до объема 100 мкл PBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА.
- Определите количество aAPC для добавления, рассчитав на основе соотношения 1011 aAPC-связанных, загруженных пептидами MHC-Ig на каждые 106 CD8+ Т-клеток.
- Инкубировать частицы aAPC и CD8+ Т-клетки в течение 1 ч при 4 °C с непрерывным перемешиванием в стерильной полистирольной пробирке с круглым дном объемом 5 мл.
- Готовьте добавки и фактор роста Т-клеток (TCGF) для элюирования и культивирования CD8+ Т-клеток.
- В качестве дополненных сред добавьте полный состав RPMI 1640 (с глутамином) с 1 заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата натрия, 0,4 раствора витамина, 92 мкМ 2-меркаптоэтанола, 10 мкМ ципрофлоксацина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
- Чтобы сделать TCGF, следуйте установленным протоколам.
заметка: TCGF представляет собой собственный коктейль из иммунных цитокинов человека, который необходим для обеспечения Т-клеток дополнительными сигналами стимуляции, необходимыми для роста. TCGF может быть заменен на известные цитокины, стимулирующие Т-клетки, такие как IL-2, IL-7 или IL-15; однако каждый из них может соответствующим образом поляризовать ответ Т-клеток.
- Промойте и обогатите смесь aAPC и CD8+ Т-клеток.
- Промойте магнитные частицы aAPC, сначала используя буфер PBS с 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА, во-вторых, с помощью дополненной среды, и в-третьих, с помощью дополненной среды с 1% TCGF.
- Элюируйте aAPC и обогащенные CD8+ Т-клетки в 500 мкл дополненной среды с 1% TCGF.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и планшета с U-образным дном 96 в концентрации 160 мкл на лунку дополненной среды с 1% TCGF в концентрации 2,5 x 105 CD8+ Т-клеток/мл.
- При выделении с использованием aAPC только с нагруженным пептидами MHC-Ig на поверхности (без костимулирующих сигналов), то выполните шаг 4.5. При выделении с использованием aAPC с нагруженными пептидами MHC-Ig на поверхности и костимулирующими сигналами, переходите к этапу 5.
- Добавьте магнитные частицы, покрытые костимулирующими сигналами на поверхности, к обогащенной фракции и добавьте магнитное поле для совместной кластеризации стимулирующих сигналов на поверхности Т-клеток.
- К обогащенным фракциям добавьте эквимолярное (или большее в зависимости от применения - см. раздел о свойствах aAPC для контроля) стимулирующее антитело к количеству пептид-загруженных MHC-Ig на частице.
- Позволяет костимулирующим магнитным частицам связываться с обогащенными CD8+ Т-клетками в течение 1 ч при 4 °C.
- Добавьте магнитное поле, поместив культуральную пластину между двумя неодимовыми магнитами-дисками N52 длиной 1,9 см (0,75 дюйма).
заметка: Дисковые магниты N52 обладают чрезвычайно сильным полем. Следует соблюдать осторожность при хранении их с прокладками между магнитами, так как их трудно отделить друг от друга, когда они помещаются на планшеты для культур. Чтобы свести к минимуму прилипание магнитов к металлическим компонентам инкубатора, поместите их в конические трубчатые контейнеры из пенополистирола объемом 50 мл как снизу, так и сверху.
2. Расширение и обнаружение антиген-специфичных CD8+ Т-клеток с помощью подготовленных искусственных антигенпрезентирующих клеток с наночастицами
- Добавьте 96 U-образный луночный планшет с aAPC и CD8+ Т-клетками в увлажненный инкубатор с 5%CO2, 37 °C на 3 дня. На 3-й день накормите клетки 80 мкл на лунку добавкой 2% TCGF и поместите их обратно в инкубатор до 7-го дня.
- На 7-й день соберите стимулированные клетки в пробирку с круглым дном объемом 5 мл для подсчета.
- После того, как весь раствор будет собран, раскрутите собранные клетки для ресуспендирования в 0,5 мл PBS с 0,05% азида натрия и 2% FBS. Подсчитывают жизнеспособные клетки путем окрашивания трипановым синим и подсчета на гемоцитометре.
- Удалите 50 000-500 000 подсчитанных клеток в две новые пробирки с круглым дном объемом 5 мл для антиген-специфического окрашивания. Одна пробирка будет использоваться для окрашивания родственным пептидом MHC, а другая пробирка будет использоваться для неродственного окрашивания для определения фонового окрашивания.
- Добавьте 1 г биотинилированного MHC-Ig в соответствующие родственные и неродственные пробирки в 100 мкл PBS с 0,05% азидом натрия и 2% FBS с аллофикоцианином (APC)-конъюгированным крысиным антимышиным CD8a, клон 53-6,7 (коэффициент разведения 1:100) в течение 1 ч при 4 °C.
- Добавьте вторичный стрептавидин и морилку для живого мертвеца. Промойте избыток биотинилированного MHC-Ig с помощью PBS с помощью центрифугирования. Затем окрасьте все образцы в соотношении 1:350 меченного фикоэритрином (ПЭ) стрептавидином и в соотношении 1:1000 живого/мертвого корректируемого зеленого цвета мертвых клеток в течение 15 минут при 4 °C.
- Считайте все образцы на проточном цитометре для определения специфичности и количества антиген-специфических клеток.
- Смойте излишки вторичных и живых/мертвых пятен центрифугированием и повторно суспендируйте 150 мкл буфера PBS с 0,05% азидом натрия и 2% FBS для считывания на проточном цитометре.
- Определите количество и процент антиген-специфических клеток с помощью программного обеспечения для анализа данных.
- Чтобы определить процент антиген-специфических клеток, используйте следующие вентили в соответствующем порядке: live+, lymphocyte+ (прямое рассеяние по боковому рассеиванию), CD8+ и Dimer+. Определите вентиль Dimer+, сравнив неродственное и родственное окрашивание.
- Определите процент антиген-специфических клеток в образце путем вычитания процента Dimer+ родственного красителя MHC-Ig из неродственного окрашивания MHC-Ig.
- Используя этот процент антиген-специфичных клеток, умножьте его на количество подсчитанных клеток, получив количество антиген-специфических клеток, полученных в результате обогащения и расширения><.
заметка: Компенсация должна быть установлена на проточном цитометре, так как существует спектральное перекрытие с флуорофорами, используемыми в этой панели.