Метод выделения первичных тучных клеток из брюшинной полости мыши

Аннотация

Источник: Цвиловский, В., и др. Выделение тучных клеток, полученных из брюшины, и их функциональная характеристика с помощью Ca2⁺-визуализации и анализов дегрануляции. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует метод перитонеального лаважа для выделения зрелых тучных клеток соединительнотканного типа из брюшинной полости взрослых мышей. После выделения смеси первичных иммунных клеток из брюшной полости проводят селективную пролиферацию тучных клеток в соответствующих условиях культивирования.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Выделение ПМК методом внутрибрюшинного лаважа

1. Перед изоляцией клеток подготовьте материалы, перечисленные в таблице 1.
2. Используйте мышей мужского пола в возрасте от 8 до 14 недель для изоляции PMC. Усыпьте мышь путем вдыхания CO₂ и подтвердите смерть от потери рефлексов. Сбрызните мышь 70% этанолом и закрепите ее на поролоновом блоке с помощью булавок (тыльной стороной вниз). Снимите брюшную кожу мыши с помощью ножниц с тупыми краями. Избегайте повреждения брюшной полости.
   заметка: Обычно мы используем этот протокол для мышей с генетическим фоном штамма C57BL/6N.
3. Введите 7 мл ледяной среды RPMI и 5 мл воздуха в брюшную полость с помощью шприца объемом 10 мл, оснащенного иглой 27 G. Осторожно вдавливайте иглу в брюшину и не прокалывайте никаких органов. Используйте пятно в области жировой ткани придатка яичка, чтобы снизить риск перфорации органа.
4. После инъекции встряхните мышь в течение 1 минуты, чтобы удалить клетки брюшины в среду RPMI. Не трясите мышь слишком сильно, чтобы не повредить внутренние органы и не загрязнить кровью брюшную полость.
5. Повторно используйте шприц объемом 10 мл, оснастив его новой канюлей 20 г. Сдвиньте внутренние органы в одну сторону, наклонив поролоновый блок и осторожно постучав им по скамье, чтобы облегчить аспирацию среды с другой стороны. Введите иглу 20 G, нанесите скос вверх и осторожно и медленно (~0,5 мл/с) отсасывайте жидкость из брюшной полости, чтобы избежать закупорки внутренними органами. Соберите как можно больше жидкости (обычно 5–6 мл).
6. Извлеките иглу из шприца и перенесите собранную клеточную суспензию в сборную пробирку на льду. Выбросьте пробирку с образцом, если есть видимое загрязнение крови.
7. Центрифугируйте пробирки с клеточной суспензией при давлении ~300 x g в течение 5 минут. Под стерильным капюшоном отсасывают надосадочную жидкость. Для каждой мыши смешайте образцы гранул в 4 мл холодной (4–10 °C) среды PMC и перенесите клеточную суспензию в колбу^{для культур размером} 25 см2. Добавьте факторы роста IL-3 и SCF до конечных концентраций 10 нг/мл и 30 нг/мл соответственно. Поместите колбу с клетками в инкубатор (37 °C и 5%_CO2) и инкубируйте в течение ~48 часов до следующей процедуры.

Таблица 1: Материалы для шага 1.

1	лёд
2	Шприцы 10 мл
3	Иглы 27 г
4	Иглы 20 г
5	Блок из пенополистирола и штифты
6	Пробирки для сбора (пластиковые центрифужные пробирки объемом 50 мл)
7	70% этанол
8	RPMI Medium (предварительно охлажденный и выдержанный на льду)
9	Среда PMC: RPMI Medium + 20% FCS (сыворотка для телят) + 1% раствор пенициллина стрептомицина (Pen-Strep)
10	Фосфатный буферный раствор Дульбекко - DPBS (без Ca2+ и Mg2+)
11	Колбы для культур (25 см)
12	Исходные растворы факторов роста (IL-3: 1 μг/μл; SCF: 2,5 мкг/мл)
13	Серологические пипетки (10 мл)
14	Наконечники для пипеток стерильные (20–200 μл)
15	Гемоцитометр
16	Настольная центрифуга
17	Ножницы и щипцы
18	Камера CO2 для мышей
19	Открытая стерильная капюшон
20	Закрытый стерильный капюшон
21	Клеточный инкубатор (37 °C и 5%CO2)
22	Трансферные пипетки (20–200 μл)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
RPMI Medium	Термо Сайентиал	21875034
ДПБС	Сигма-Олдрич	14190144
ФТС	Термо Сайентиал	Р92157
Ил-3	Системы НИОКР	403-МЛ
СКФ	Термо Сайентиал	PMC2115
Пенстреп	Термо Сайентиал	15140122
Колбы для культур (25 см)	Greiner Bio-One	Номер 69160
Пластиковые центрифужные пробирки объемом 15 мл	Сарштедт	6,25,54,502
Настольная центрифуга	Герей	Мегафуга 1.0Р