Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Изготовление устройств и мягкая литография
ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания микроканала полидиметилсилоксана (PDMS) использовались стандартные методы мягкой литографии.
- Смешайте прекурсор PDMS в соотношении основания и отвердителя 10:1.
- Залейте 30 г смеси прекурсора PDMS в микрообработанную алюминиевую форму (размеры см. на рисунке 1) и 20 г смеси прекурсора PDMS в чашку Петри диаметром 100 мм. <бр/>
заметка: Чашка Петри используется для изготовления толстой пленки PDMS (~3 мм) для несущего слоя. Поддерживающий слой PDMS обеспечивает однородные физические свойства поверхности во всей микрофлюидике. В качестве альтернативы можно использовать тонкую пленку PDMS на предметном стекле. Мастер-форма с определенными размерами канала была спроектирована и изготовлена методом микрофрезерования на алюминиевом листе. Спиральный канал, использованный в этом исследовании, представлял собой 8-петлевой спиральный микроканал с одним входом и двумя выходами, с радиусом, увеличенным с 8 мм до 24 мм для эффективного разделения по размеру.
- Поместите форму и чашку Петри в вакуумный эксикатор для дегазации до тех пор, пока на поверхности не останутся пузырьки, обычно 5-10 мин. Используйте домашний пылесос для эксикатора.
- Отпустите вакуум и поместите форму и чашку Петри в духовку при температуре 90 °C на 1 ч.<бр/>
заметка: Вместо духовки можно использовать конфорку или другие нагревательные инструменты.
- Выньте форму и чашку Петри из духовки и дайте ей остыть при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Аккуратно вырежьте контур и проделайте отверстия для доступа к жидкости на устройстве с помощью перфоратора диаметром 2 мм.
заметка: Размер пуансона может варьироваться в зависимости от размера трубки или направляющей жидкости.
- Приклейте ленту со стороны канала устройства и плотную пленку PDMS, а затем осторожно отклейте щипцами для удаления пыли.
- Обработайте как канальную сторону устройства, так и гладкую PDMS воздушной плазмой и соедините с подготовленным поддерживающим слоем гладкой PDMS (рис. 1A).
- Поместите чип на предметное стекло размером 50 мм x 70 мм и поместите его в духовку при температуре 70 °C не менее чем на 30 минут, чтобы повысить прочность сцепления.
2. Сбор секрета трахеи у пациентов на искусственной вентиляции легких
ПРИМЕЧАНИЕ: Выделения из трахеи могут быть получены от пациентов с искусственной вентиляцией легких во время обычного рутинного ухода за дыхательными путями, используя протокол, модифицированный из традиционных методов для стандартного взрослого пациента на искусственной вентиляции легких. Образцы были обезличены и немедленно отправлены на обработку.
- Если показана аспирация трахеи, используйте катетер для извлечения секрета из дыхательных путей.
- Осторожно введите катетер наполовину в эндотрахеальную трубку и введите 5 мл 0,9% стерильного физиологического раствора из предварительно заполненного шприца объемом 10 мл.
- Когда катетер полностью продвинется или будет достигнуто сопротивление, аспирируйте выделения и соберите их в стерильный контейнер для сбора мокроты.
- Соберите 10 мл трахейного секрета в стерильный контейнер с мокротой и положите его на лед. Немедленно отправьте образцы на обработку.
3. Подготовка образцов секрета трахеи
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты должны проводиться в шкафу биобезопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
- Диспергируйте 1 мл образцов секрета дыхательных путей в 9 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с помощью пластикового шприца объемом 10 мл (для 10-кратного разведения). Используйте тупую пипетку для гомогенизации образца слизи.
- Процедите разбавитель с помощью нейлонового клеточного фильтра 40 мкм, чтобы удалить большие куски или сгустки крови, которые могут блокировать отверстие для доступа микрофлюидики или канал. После обработки поместите образец на лед.
- Диспергируйте разбавитель каждого образца с помощью буфера PBS в 100 раз, в результате чего получится разбавленная в 1 000 раз суспензия. Поместите образец на лед в течение всей операции диссоциации.
4. Экспериментальная установка
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты должны проводиться в шкафу биобезопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
- Соберите микросхему PDMS с направляющей жидкости, чтобы обеспечить равномерный поток в каждом из четырех спиральных микроканалов (рис. 1B).
заметка: Четыре канала были использованы для увеличения пропускной способности за счет распараллеливания, а также оптимизации объема и плотности ячеек полученной суспензии. Проводник жидкости спроектирован и изготовлен с помощью стереолитографического 3D-принтера с прозрачной смолой. Во входном и выходном отверстиях проводника жидкости используются гнездовые соединители Luer для простоты подключения и стабильного уплотнения во время работы.
- Подсоедините штекерный разъем Люэра 1/16 дюйма к входному отверстию, выходному отверстию внутренней стенки (IW) и выходному отверстию внешней стенки (OW) проводника жидкости и подсоедините силиконовую трубку к суспензии образца.
- Вставьте тупые наконечники на каждый конец впускного и выпускного отверстий, чтобы добраться до дна резервуара для пробы.
- Подсоедините перистальтический насос к впускной трубке.
- Поместите конец входной трубки и выпускной трубки IW в резервуар для образца, а конец выпускной трубки OW поместите в резервуар для отходов (рис. 1C, D).
- Поместите в резервуар для образца пробирку объемом 50 мл с фильтрованным PBS без кальция и магния.
- Начните откачку с низким расходом (~1 мл/мин) для заправки устройства.
заметка: Когда пузырьки попадут в канал, надавите пинцетом на верхнюю часть канала, чтобы дестабилизировать и устранить пузырьки воздуха. Когда устройство будет полностью заполнено буферным раствором, замените пробирку PBS для подготовки пробирки для отбора проб секрета дыхательных путей.
- Когда проба будет помещена в резервуар для пробы, включите перистальтический насос и установите скорость потока на уровне 4 мл/мин (рис. 1C, D).
- Когда объем образца достигнет заданного объема (~1 мл), остановите работу и отсоедините силиконовую трубку.
заметка: Предложенный метод более эффективен при уменьшении большого объема разбавителя (>50 мл) до объема микроцентрифужной пробирки (~1 мл) (рис. 2).
