Мечение мышиных Т-хелперных лимфоцитов с помощью радиоактивно меченых моноклональных антител

Аннотация

Источник: Hoffmann, S. H. L., et al., Мечение мышиных лимфоцитов с помощью ⁶⁴рецептора антител Cu для трафика клеток in vivo с помощью ПЭТ/КТ. J. VIS. Exp. (2017)

В этом видео мы демонстрируем внутриклеточное радиоактивное мечение Т-хелперов с использованием радиоактивных моноклональных антител, конъюгированных изотопами, для неинвазивной позитронно-эмиссионной томографии.

Протокол

1. Радиоактивное мечение клеток cOVA-TH1

ПРИМЕЧАНИЕ: ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb будут применяться к культивируемым клеткам cOVA-TH1 для обеспечения внутриклеточной радиоактивной маркировки.

1. Для радиоактивного мечения клеток cOVA-TH1 введите 37 МБк меченного ^{радиоактивным веществом 64}Cu-DOTA-KJ1-26-mAb в шприц без мертвого объема с помощью калибратора дозы. Добавьте 1 мл физиологического раствора, чтобы получить раствор в концентрации 37 МБк/мл.
2. Суспензируйте клетки cOVA-TH1 в среде в концентрации 2 x 10⁶ клеток/мл и добавьте по 0,5 мл клеточной суспензии в каждую лунку в 48-луночном планшете.
3. Добавьте 20 μL свежеприготовленного раствора 37 MBq/мл ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb в каждую лунку 48-луночного планшета. Итоговое соотношение для мечения составляет 0,7 МБк на 10⁶ клеток в объеме 520 мкл. Инкубировать при 37 °С и 7,5%_СО2 в течение 30 мин.
4. После инкубации осторожно ресуспендируйте клетки в каждой лунке и перенесите клеточную суспензию из 48-луночного планшета в пробирку с винтовой крышкой объемом 50 мл. Чтобы свести к минимуму потерю клеток, промойте каждую лунку предварительно подогретой средой.
5. Центрифугируйте клеточную суспензию cOVA-TH1 при 400 x g в течение 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 10 мл предварительно подогретого PBS. Удалите аликвоту клеточной суспензии для подсчета клеток. Повторите этап стирки.
6. Подсчитайте жизнеспособные клетки cOVA-TH1 в соответствующем разведении с окрашиванием трипановым синим.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модуль обработки 64Cu	WKL	Изготовление на заказ	Производство 64Cu
Калибратор дозы	Капинтек	КРЦ-25Р
Циклотрон PETtrace	Дженерал Электрик Медикал Системс
DOTA-NHS	Макроциклика	Б-280
Антитела к cOVA-TCR (KJ1-26)		Выделен из культуры клеток гибридомы	DOTA-конъюгация
Na2HPO4	Сигма-Олдрич	71633	DOTA-конъюгация
H+ Chelex 100	Сигма-Олдрич	С7901	DOTA-конъюгация
Фильтрующий блок Amicon Ultra-15	Мерк Миллипор	UFC910008	DOTA-конъюгация
Ротипурановая сверхчистая вода	Карл Рот	ХН68.3	DOTA-конъюгация
Ацетат аммония	Сигма-Олдрич	Номер 32301	DOTA-конъюгация
ПБС	Университет Тюбингена		DOTA-конъюгация
Колонка Micro Bio-spin P-6	Лаборатории Bio-Rad	7326221	DOTA-конъюгация
Цитрат натрия	Сигма-Олдрич	71497	DOTA-конъюгация
Циклон плюс ЛюминофорИмиджер	Перкин-Элмер	L2250116	DOTA-конъюгация
DMEM	Мерк Миллипор	102568	Ингредиент для Т-клеточной среды
ФТС	Мерк Миллипор	С0115/1004Б	Ингредиент для Т-клеточной среды
Пируват натрия	Мерк Миллипор	Л0473	Ингредиент для Т-клеточной среды
MEM-аминокислоты	Мерк Миллипор	К0293	Ингредиент для Т-клеточной среды
ХЕПЕС	Мерк Миллипор	Л 1613	Ингредиент для Т-клеточной среды
Пенициллин/стрептомицин	Мерк Миллипор	А2212	Ингредиент для Т-клеточной среды
0,05 мМ 2-β-меркаптоэтанол	Сигма-Олдрич	М3148	Ингредиент для Т-клеточной среды
DO11.10 мыши		Разведение в домашних условиях	Культура клеток TH1
ДПБС	Gibco	14190144	Культура клеток TH1
Сетчатый фильтр для ячеек 40 μм	Корнинг	352340 (Английский	Культура клеток TH1
Лизирующий буфер ACK	Лонза	10-548Э	Культура клеток TH1
CD4 Микрогранулы, мышь	Милтеньи Биотех	Тел.: 130-097-145	Культура клеток TH1
Сепаратор QuadroMACS	Милтеньи Биотех	Тел.: 130-090-976	Культура клеток TH1
Колонна LS	Милтеньи Биотех	Тел.: 130-042-401	Культура клеток TH1
Антитела к CD4 (Gk1.5)		Выделен из культуры клеток гибридомы	Культура клеток TH1
Антитела к CD8 (5367.2)		Выделен из культуры клеток гибридомы	Культура клеток TH1
Антитела к крысам (MAR18.5)		Выделен из культуры клеток гибридомы	Культура клеток TH1
Кролик комплемент МА	тебу-био	КЛ3221	Культура клеток TH1
Антитела к IL-4 (11B11)		Выделен из культуры клеток гибридомы	Культура клеток TH1
cOVA 323-339-пептид	Микроколлекции EMC	Индивидуальный заказ	Культура клеток TH1
CPG1668-олигонуклеотиды	Eurofins MWG Operon	Индивидуальный заказ	Культура клеток TH1
Ил-2	Компания «Новартис»	65483-116-07	Культура клеток TH1
96-луночные планшеты	Грейнер	655180 (Английский	Культура клеток TH1
24-луночные планшеты	Грейнер	Номер 662160	Культура клеток TH1
Колба для клеточных культур	Грейнер	660175	Культура клеток TH1
48-луночные планшеты	Грейнер	677 180	Маркировка клеток
Гаммаселл 1000	Лучшая тератроника	Через запрос
Гульмай RT225	Гульмай	Через запрос
Трипан синий	Мерк Миллипор	Л6323	Оценка in vitro

) )