Метод in vitro для дифференцировки Т-хелперов, продуцирующих GM-CSF, от наивных Т-клеток

Аннотация

Источник: Lu, Y., et al. Дифференцировка in vitro мышиных клеток Т-хелпера (T_HGM) гранулоцитарно-макрофагального-колониестимулирующего фактора (GM-CSF)-продуцирующих их клеток.J. Vis. Exp. (2018).

Это видео демонстрирует in vitro дифференцировку гранулоцитарно-макрофаг-колониестимулирующего фактора или GM-CSF-продуцирующих Т-хелперов (T_HGM). Выделенные наивные Т-клетки стимулируют к дифференцировке в_THGM, что подтверждается обнаружением высокой внутриклеточной продукции GM-CSF и низкой экспрессии других цитокинов, специфичных для Т-хелперных клеток.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Подготовка реагентов и материалов

1. Приготовьте 500 мл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
   заметка: Держите буфер на льду на протяжении всей процедуры для достижения оптимальных результатов.
2. Приготовьте 50 мл полной среды RPMI, содержащей RPMI 1640, 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина. Используйте полную среду RPMI, содержащую 50 мкМ β-меркаптоэтанол, для дифференцировки клеток T_HGM. Добавьте β-меркаптоэтанол в вытяжной шкаф.
3. Приготовьте 7,5 мл смеси анти-CD3e антител путем разбавления концентрированного анти-CD3e концентрата до 3 мкг/мл в PBS. Покройте 48-луночные планшеты, добавив 150 мкл смеси антител в каждую лунку, и инкубируйте планшет при 37 °C в течение не менее 1 ч или при 4 °C в течение ночи.
4. Простерилизуйте ножницы и щипцы и держите их в 70% этаноле между вскрытиями.

2. Получение спленоцитов мышей

1. Усыпьте мышь (в возрасте 6–8 недель) с помощью одобренной в учреждении асфиксии CO₂ или вывиха шейки матки. Распылите на мышь 70% этанол и закрепите ее на полистирольном блоке на задней стороне. Перенесите мышь в шкаф биологической безопасности, чтобы выполнить следующие действия.
2. Удерживайте кожу с помощью щипцов и разрежьте кожу ниже грудной клетки с левой стороны примерно на 4 см с помощью ножниц. Откройте брюшный мешок, чтобы обнажить селезенку, и используйте стерильные щипцы для извлечения селезенки.
3. Поместите клеточное ситечко 70 мкм на пробирку объемом 50 мл и предварительно смочите ее 2 мл буфера. Поместите селезенку на клеточное ситечко (2–3 селезенки на одно клеточное ситечко) и размочите их с помощью конца поршня шприца объемом 5 мл.
4. Промойте ситечко и пробирку несколько раз 1–2 мл буфера для изоляции клеток, пока все клетки не будут смыты в пробирку. Выбросьте сетчатый фильтр и центрифугируйте клетки при 350 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
5. Суспендируйте клеточную гранулу 5 мл холодного (4 °C) лизирующего буфера на основе аммония-хлорид-калия (ACK) (150 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃, 0,1 мМ Na₂EDTA; pH 7,2–7,4) и аккуратно перемешайте их в течение 2 мин. Добавьте 10 мл полной среды RPMI для нейтрализации буфера ACK и немедленно центрифугируйте клетки при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования.

3. Выделение CD4⁺ Т-клеток с помощью магнитных микрогранул CD4 и колонки для разделения клеток

1. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 5 мл буфера для изоляции клеток. Отфильтруйте суспензию клетки с помощью фильтра предварительного разделения (30 мкм) в новую пробирку объемом 15 мл, чтобы удалить любой мусор.
2. Возьмите 10 μL клеточной суспензии и сделайте 10-кратное разбавление, добавив 90 μL буфера. Возьмите 10 мкл разбавленной клеточной суспензии и смешайте ее с 10 мкл трипанового синего для подсчета клеток. Подсчитайте клетки в гемоцитометре, чтобы определить выход жизнеспособных клеток.
3. Центрифугируйте клетки при 350 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
4. Ресуспендируйте клетки в буфере по 90 мкл на^10-7 клеток. Добавьте 10 мкл магнитных гранул CD4 на^10-7 клеток. Инкубируйте клетки в течение 15 минут при 4 °C. Для достижения оптимальных результатов осторожно перемешивайте клеточную суспензию каждые 5 минут во время инкубации.
5. Пока клетки инкубируются, поместите разделительную колонку на магнитную подставку. Предварительно смочите колонку 2 мл буфера.
6. В конце инкубации клеток/шариков промойте клетки 5 мл буфера и центрифугируйте их при 350 x g в течение 5 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
7. Повторно суспендируйте клетки в 1 мл буфера, загрузите образец в колонку для разделения клеток и дайте ему пройти. Используйте центрифужную пробирку объемом 15 мл для сбора фракции CD4-клеток. Добавьте 1 мл буфера, чтобы промыть резервуар до того, как он высохнет. Повторите шаг стирки 2 раза.
8. Снимите колонну для разделения клеток с магнитной подставки и поместите ее на новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл изоляционного буфера в колонну для разделения клеток и плотно приложите поршень, чтобы вытеснить клетки из колонки.
9. Центрифугируйте фракцию при 350 х г в течение 5 мин при 4 °C для получения CD4⁺ клеток. Выбросьте надосадочную жидкость.

4. Очистка наивных CD4⁺ Т-клеток (CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi) с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток и дифференцировки T_HGM

1. Ресуспендируйте полученную клеточную гранулу CD4⁺ в 500 мкл буфера. Смешайте клетки со смесью флуоресцентно-конъюгированных антител, содержащей CD4-PerCp (2,8 мкг/мл), CD44-APC (2,4 мкг/мл), CD25-PE (2 мкг/мл) и CD62L-FITC (10 мкг/мл) (Таблица 1). Инкубируйте клетки на льду в течение 20–30 минут, защищая их от света.
   заметка: Концентрации антител были оптимизированы ранее в лаборатории. Количество антител указано для клеток 1–2 мышей.
2. После инкубации промойте клетки 5 мл буфера и центрифугируйте клетки при 350 x g в течение 5 минут при 4 °C.
3. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в 500 мкл буфера. Еще раз отфильтруйте ячейки с помощью капроновой сетки.
4. Перенесите клеточную суспензию в трубку FACS для сортировки клеток. Предварительно покройте коллекционные пробирки FACS 500 мкл буфера.
5. Получите популяцию CD4⁺CD25-CD44^loCD62L^hi (наивных CD4⁺ Т-клеток) с помощью сортировки FACS. Сначала загейтируйте на CD4⁺CD25^-, а затем выберите CD44^loCD62L^{hi-клетки} из этой популяции.
6. Соберите наивные фракции CD4⁺ Т-клеток в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 350 x g в течение 5 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируйте наивные CD4⁺ Т-клетки в концентрации 106 клеток/мл в полной среде RPMI, содержащей 50 мкМ β-меркаптоэтанол.
8. Аспирируйте анти-CD3e антитела, используемые для предварительного покрытия в 48-луночном планшете. Засейте 0,25 млн (250 мкл) клеток в каждой лунке с IL-7 (2 нг/мл), анти-CD28 (1 мкг/мл) и анти-IFNγ (10 мкг/мл) (Таблица 1).
   заметка: Концентрации цитокинов и антител были предварительно оптимизированы в лаборатории для дифференцировки клеток_THGM.
9. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2 в течение 3 дней. Не меняйте среду во время инкубации.

5. Анализ мышиных клеток ТГ ГМ, полученных in vitro

1. С помощью микроскопа проверьте дифференцировку клеток через 3d после дифференцировки. Соберите клетки и центрифугируйте их при 350 x g в течение 5 минут при 4 °C. Промойте клетки 2 раза полным фильтрующим материалом RPMI.
   заметка: Дифференцированные клетки больше по размеру, чем наивные CD4⁺ Т-клетки.
2. Ресуспендируйте клетки в 1 мл полной среды RPMI. Возьмите 10 μл клеточной суспензии и хорошо перемешайте ее с 10 μл трипанового синего для определения количества клеток с помощью гемоцитометра. Разделите дифференцированные клетки на три зелья для рестимуляции и анализа.
   заметка: Для внутриклеточного окрашивания цитокинов требуется ≥0,5 млн клеток.
3. Для внутриклеточного окрашивания цитокинов рестимулируют клетки форболом 12-миристат 13-ацетатом (PMA) (100 нг/мл) и иономицином (1 мкг/мл) в присутствии ингибитора переноса белка (1 мкл/мл) в течение 4–6 ч.
   1. Соберите клетки и окрашивайте их анти-CD4 антителами (PerCP-конъюгированные, 0,2 мг/мл, 1:100; или FITC-конъюгированные, 0,5 мг/мл, 1:100) в течение 30 минут.
   2. Зафиксируйте ячейки 200 мкл фиксирующего буфера на 20–60 минут. После фиксации промойте клетки 2 раза 1 мл пермеабилизационного буфера.
   3. Проводят внутриклеточное окрашивание антителами против GM-CSF (PE-конъюгированный, 0,2 мг/мл, 1:100 разведения), IL-17A (FITC-конъюгированный, 0,5 мг/мл, 1:100 разведения; APC-конъюгированный, 0,2 мг/мл, 1:100 разведение), IL-4 (APC-конъюгированный, 0,2 мг/мл, 1:100 разведение) и IFNγ (APC-конъюгированный, 0,2 мг/мл, 1:100 разведение; ПЭ-конъюгированный, 0,2 мг/мл, разведение 1:100) в течение 30 минут в темноте.

Таблица 1: Используемые цитокины и антитела.

имя	Концентрация запасов	Рабочая концентрация	разбавление	Объем в буфере для окрашивания 500 мкл
CD4-PerCp	0,2 мг/мл	2,8 мкг/мл	1:71	7 μл
CD44-APC	0,2 мг/мл	2,4 мкг/мл	1:83	6 μЛ
СД25-ПЭ	0,2 мг/мл	2 мкг/мл	1:100	5 μл
КД62Л-ФИТК	0,5 мг/мл	10 мкг/мл	1:50	10 μл
ГМ-КСФ-ПЭ	0,2 мг/мл	2 мкг/мл	1:100
Ил-17А-ФИТЦ	0,5 мг/мл	5 мкг/мл	1:100
Ил-17А-БТР	0,2 мг/мл	2 мкг/мл	1:100
ИФНγ-АПК	0,2 мг/мл	2 мкг/мл	1:100
ИФНγ-ПЭ	0,2 мг/мл	2 мкг/мл	1:100
Ил-4-БТР	0,2 мг/мл	2 мкг/мл	1:100
CD4-FITC	0,5 мг/мл	5 мкг/мл	1:100
Ил-7	20 мкг/мл	2 нг/мл	1:10000
Анти-CD28	0,5 мг/мл	1 мкг/мл	1:500
Анти-IFNγ	1 мг/мл	10 мкг/мл	1:100

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
РПМИ 1640	Биозапад	Л0500-500
FBS с термоинактивацией	Козерог	FBS-HI-12A
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140122
10x PBS	1-я база	БУФ-2040-10	Разведенный до 1x PBS в стерильной воде
Эдта	1-я база	BUF-1053-100ml-pH8.0
10X буфер ACK	Биолегенда	420301	разведенный в стерильной воде
Сетчатый фильтр для клеток	SPL Медико-биологические науки	93070
Микрогранулы CD4	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-049-201
2-Меркаптоэтанол	сигма	М7522
Колонна LS	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-401
Магнитная подставка	Милтеньи Биотек	Тел.: 130-042-303
Шприц 1 мл	Терумо	СС+01Т
центрифуга	Эппендорф	Эппендорф 5810R
Сортировщик ячеек Sony SY3200	сони	Сортировщик ячеек Sony SY3200
Коническая центрифужная пробирка 50 мл	Greiner Bio-One	210261
Коническая центрифужная трубка 15 м	Greiner Bio-One	188271
Трубка FACS	Корнинг	352054
антимышиный CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
ПЭ-конъюгированный антимышиный CD25 (IL-2Ra, p55)	eBioscience	Тел.: 12-0251-82
античеловеко-мышиный CD44 APC	eBioscience	17-0441-82
антимышь CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85 (Английский)
Усовершенствованная счетная камера Neubauer	Мариенфельд	Номер 640010
Гиклон Трипан Блю Раствор	GE здравоохранение Медико-биологические науки	SV30084.01
микроскоп	Компания Nikon	Фотоаппарат Nikon Elipse TS100
Очищенное антитело к мышиному CD3e	Биолегенда	100314
Очищенный хомяк против мыши CD28	BD Biosciences	553295
Очищенный Крысиный антимышиный ИФНγ	eBioscience	Тел.: 16-7312-85
Очищенное антитело к мышиному IL-4	Биолегенда	504102
Рекомбинантный мышиный белок IL-7	Система исследований и разработок	407-МЛ
ПМА	Мерк Миллипор	19-144
Иономицин	сигма	И0634
Ингибитор транспорта белка GolgiPlug	BD Biosciences	51-2301КЗ
Набор буферов для внутриклеточной фиксации и пермеабилизации	eBioscience	88-8824-00
антимышиный GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
Антимышиный FITC IL-17A	Биолегенда	506908
APC антимышиный ИФН-гамма	Биолегенда	No 505810