Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Диссоциация мозга и магнитная микроглиальная изоляция
ПРИМЕЧАНИЕ: Все манипуляции с клетками и ресуспендирование должны выполняться с помощью пипетки объемом 1,000 мкл с большой осторожностью. Применение сильного механического воздействия может активировать или убить клетки микроглии.
- Перенесите 12 кусочков мозга (~1,2 г) в каждую диссоциационную трубку, содержащую диссоциационную смесь, согласно таблице 1. Для 24 щенков потребуется четыре С-образные трубки (Рисунок 1A-B).
- Поместите С-образные трубки на диссоциатор (с режимом нагрева). Запустите оптимизированную программу NTDK в оборудовании в соответствии с инструкциями производителя (рисунок 1D).
- Центрифугируйте при 300 x g в течение 20 с (при 4 °C) для сбора всех клеток. Завершите механическую диссоциацию путем трехкратного пипетирования вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1 000 мкл (рис. 1E).
- Переложите клетки в четыре пробирки по 15 мл + ситечки. Промойте ситечки 10 мл 1x сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) с Ca2+ и Mg2+ (HBSS+/+) (рис. 1F).
- Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин (при 4 °C) и удалите надосадочную жидкость. Осторожно повторно суспендируйте гранулу 10 мл HBSS+/+ (рис. 1G).
- Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин (при 4 °C) и удалите надосадочную жидкость. Осторожно суспендируйте гранулу с 6 мл сортировочного буфера (1x PBS + 0,5% BSA) (Рисунок 1H).
- Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин (при 4 °C) и удалите надосадочную жидкость. Добавьте 200 мкл раствора CD11b-микрогранул в каждую пробирку и осторожно ресуспендируйте (рис. 1I).
- Инкубируйте пробирки в течение 15-20 мин при 4 °C. Осторожно ресуспендируйте гранулу 6 мл сортировочного буфера (рис. 1I-J).
- Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин (при 4 °C) и удалите надосадочную жидкость. Осторожно суспендируйте гранулу с 8 мл сортировочного буфера (рис. 1K).
- Следуйте программе POSSEL на сепараторе (см. Таблицу материалов) для подготовки восьми колонок. Переведите клетки 1 мл на 1 мл на колонку. Подождите, пока все ячейки пройдут через них, прежде чем добавлять еще один мл. Элюируйте CD11b+ клетки на стерильном элюирующем планшете с 1 мл сортировочного буфера (рис. 1L).
- Объедините CD11b+ клетки в новую пробирку объемом 50 мл (рис. 1M).
- Центрифугируйте при 300 x g в течение 10 мин (при 4 °C) и удалите надосадочную жидкость. Осторожно ресуспендируйте гранулу 10 мл среды для холодной микроглии (беспитательная среда для макрофагов в сыворотке крови (SFM) + 1% пенициллин-стрептомицина (P/S)) (рис. 1N).
- Подсчитайте количество клеток CD11b+. При P8 необходимо получить ~650 000 клеток на мозг.
заметка: В настоящем протоколе клетки подсчитывались с помощью автоматического счетчика клеток (см. Таблицу материалов).
- Ресуспендируйте клетки в холодной среде микроглии до конечной концентрации 650 000-700 000 клеток/мл и распределите в планшеты для клеточных культур.
заметка: 6-луночные планшеты предназначены для вестерн-блоттинга (2 мл на лунку); 12-луночные планшеты предназначены для анализа ОТ-кПЦР (1 мл на лунку), а 96-луночные планшеты предназначены для фагоцитарного анализа (250 мкл на лунку).
Таблица 1: Приготовление диссоциационной смеси.
г.
шт.
год
г.
| решение | Для одной С-образной трубки (μл) | Для четырех С-образных трубок (μл) |
| Буфер X | 2850 | 11400 |
| Фермент Р (папаин) | 75 | 300 |
| Фермент А (ДНКаза) | 15 | 60 |
| Буфер Y | 30 | 120 |
| итог | 2970 | 11880 |
