Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Внутрицистернальная инъекция мышам
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура выполняется в шкафу с ламинарным потоком для поддержания асептических условий.
- Домашние лабораторные мыши (8 недель, самка Balb/c) в определенных условиях, свободных от патогенов. Предоставляйте гранулы для еды и воду в неограниченном количестве.
- Поселите животных в новую среду за 1 неделю до начала эксперимента.
- Перед началом эксперимента взвесьте и оцените температуру тела.
заметка: Инбредные самки мышей Balb/c восьминедельного возраста весят в среднем около 19 г. Средняя температура лабораторных мышей физиологически колеблется в пределах 36-38 °С.
- Сотрите животное с шеи, очистите область живота 70% этанолом и введите внутримышечно декстран железа (растворенный в 1% фосфатном солевом буфере, 250 мг/кг) в нижний правый квадрант брюшной полости мыши с помощью иглы 25 G 0,5 мм x 16 мм, примерно за 2-3 часа до заражения><.
заметка: Внутрибрюшинная инъекция была выполнена в нижний правый квадрант брюшной полости мыши, чтобы избежать повреждения органов брюшной полости, таких как мочевой пузырь, слепая кишка и т. д. Введение экзогенного источника железа в форме декстрана железа животным до заражения способствует размножению бактерий в организме хозяина.
- Через 2-3 ч проводят анестезию животных кетамином (50 мг/кг) и ксилазином (3 мг/кг), а также офтальмологической смазкой.
- Проверьте глубину анестезии, убедившись в отсутствии болевой реакции на защемление пальца ноги.
- Расположите мышь в пролежневом положении грудины и осторожно растяните конечности и шейный отдел позвоночника, чтобы позвоночный столб оставался в прямом положении.
- Осторожно перемешайте бактериальную суспензию для поддержания однородности суспензии перед загрузкой шприца с иглой 30 G x 8 мм.<бр./>
заметка: Приготовьте бактериальную суспензию как можно ближе ко времени инъекции; Тем временем храните его при комнатной температуре.
- Основываясь на бактериальном титре после размораживания (КОЕ/мл), перейдите к расчету общего используемого КОЕ по отношению к общему количеству инфицированных животных (доза бактерий КОЕ на количество животных). Перейдите к расчету точного объема, который должен быть взят из флакона, чтобы получить общее количество КОЕ, применив пропорцию между титром бактерий после размораживания (КОЕ/мл) и общим титром КОЕ, полезным для инфекции n мышей (КОЕ после размораживания бактериального титра: мл = общий КОЕ: x). Установите окончательный объем в отношении общего числа инфицированных животных><.
заметка: В этих экспериментах использовался широкий диапазон титров от 104 до 109 на животное.
- Очистите операционную область 70% этанолом.
- Определите точку инъекции с помощью иглы и введите установленную КОЕ менингококков (штамм дикого типа и изогенный мутантный штамм) или бульон ГК с добавлением декстрана железа (5 мг/кг) в качестве контроля, в общем объеме 10 μл в большую цистерну мышей через затылочное отверстие с помощью иглы 30 G х 8 мм.
- Выполните цибральный инокулюм, поместив иглу в краниоцервикальный переход, а именно в дорсальное субарахноидальное пространство. Вентрофлекс наденьте на голову, чтобы сделать это пространство доступным.
- Кратко поместите животное в боковое положение, держите уши подальше и умеренно согните шею (от 90 до 100°). Следите за тем, чтобы средняя линия шеи и головы (от носа до затылка) находилась в идеально параллельном положении по отношению к столешнице.
- Прикоснитесь к крыльям атласа и убедитесь, что они перекрываются, исключая осевое вращение. Естественное углубление обычно можно затронуть на средней линии, где игла с наибольшей вероятностью войдет в затылочное отверстие.
- Безопасно выбросьте шприц и иглу после инъекции мышам Neisseria.
- Поместите животное в клетку и ждите пробуждения и полного восстановления движения.
- Держите клетки с зараженными мышами под ламинарным шкафом.
- Наблюдайте за мышами через 24 часа после заражения на предмет клинических признаков комы по шкале комы. Шкала комы: 1 = кома, 2 = не стоит вертикально после поворота на спине, 3 = стоит в вертикальном положении в течение 30 с, 4 = встает в вертикальном положении в течение 5 с, минимальная амбулаторная активность, 5 = нормально.
заметка: Когда у животных регистрировалась боль, назначали анальгезию мелоксикамом (5 мг/кг в/ч в течение всего периода исследования).
2. Выживание животных и подсчет КОЕ
- Выживание животных
- Готовят бактериальные инокуляты в различных дозах (от 10,4 до 10,9 КОЕ на мышь) для заражения животных внутримышечным путем.
- Таким же образом инокулируйте контрольных мышей бульоном ГХ, дополненным декстраном железа (5 мг/кг).
- Наблюдайте за животными на предмет клинических симптомов: взъерошенная шерсть, сгорбленный вид, переохлаждение, потеря веса, вялость или умирание каждый день в течение всего эксперимента в течение 168 ч (7 дней) не менее двух раз в день в течение всего эксперимента.
- Измеряйте массу тела и температуру с помощью цифровых весов и ректального термометра соответственно каждый день.
- Запишите выживаемость мышей в течение недели.
заметка: Регистрируйте естественную смерть животного после заражения, в то время как животные, достигшие значения комы 2 или выжившие в течение 168 часов наблюдения, будут усыплены.
- Мышей с комой 2 или выживших в течение времени наблюдения обезболивают кетамином (50 мг/кг) и ксилазином (3 мг/кг) и применяют офтальмологическую мазь.
- Убедитесь, что реакция на боль отсутствует, ущипнув палец ноги.
- Проводить эвтаназию мышей путем вывиха шейки матки и записывать их как мертвых для статистического анализа.
- Приступайте к анализу на выживание животных или подсчету КОЕ на инфицированных животных.