Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Источник и корпус мыши
- Получите мышей LysM-eGFP на генетическом фоне C57BL/6J. Получение LysM-EGFP×MyD88-/- мышей путем скрещивания мышей LysM-EGFP с мышами MyD88-/- на фоне C57BL/6J.
- Домашние мыши в виварии. Для этих исследований животные были размещены в Калифорнийском университете в Дэвисе в группах до операции и в одиночном жилье после операции. Используйте мышей в возрасте от 10 до 16 недель.
2. Бактериальный препарат и количественное определение
- Удалите интересующий биолюминесцентный штамм S. aureus из хранилища при температуре -80 °C для размораживания на льду. Прожилка на пластине агара из 5% бычьей крови. Инкубировать прожилки в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C в течение ночи (16 ч).
заметка: В данном протоколе использовался штамм ALC2906 SH1000. Этот штамм содержит челночную плазмиду pSK236 с промоторами пенициллин-связывающего белка 2, слитыми с репортерной кассетой luxABCDE от Photohabdus luminescens.
- Приготовьте триптический соевый бульон (БЩБ), смешав 0,03 г порошка БГБ на мл чистой воды, и автоклав БЩБ для стерилизации. Когда остынет, добавьте все необходимые антибиотики стерильной методикой. В этом протоколе добавьте 10 мкг/мл хлорамфеникола в TSB для отбора экспрессии челночной плазмиды pSK236, которая содержит биолюминесцентную кассету luxABCDE.
- Выберите 3-4 отдельные колонии с пластины S. aureus в TSB с 10 мкг/мл хлорамфеникола, чтобы начать культивирование в течение ночи. Инкубируйте бактерии в инкубационном шейкере при температуре 37 °C в течение ночи (16 часов).
- Начните новую бактериальную культуру из ночной культуры, разбавив образец в соотношении 1:50 в TSB с 10 мкг/мл хлорамфеникола. Культивируйте в инкубационном шейке при 200 об/мин и 37 °C.
- Через два часа после расщепления S. aureus следите за оптической плотностью на длине волны 600 нм (OD600) на спектрофотометре. Наблюдайте за зависимостью наружного диаметра600 от времени, чтобы найти рост в среднелогарифмической фазе. Для штамма ALC2906 SH1000 наружный диаметр600, равный 0,5, является среднелогарифмическим и соответствует концентрации 1 x 108 КОЕ/мл (рис. 1).
- При наружном диаметре600 0,5 промойте бактерии 1:1 ледяным DPBS. Центрифугируйте бактерии в течение 10 минут при 3 000 x g и 4 °C. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и добавьте дополнительно охлажденный DPBS и тщательно перемешайте. Еще раз центрифугируйте в течение 10 минут при 3 000 x g и 4 °C.
- Аккуратно сцедите надосадочную жидкость. Суспендируйте бактериальную гранулу в нужной концентрации. Для этих исследований соберите 3 мл ALC2906 SH1000 и ресуспендируйте в 1,5 мл PBS, что соответствует концентрации бактерий около 2 x 108 КОЕ/мл. Держите бактерии на льду до использования.
- Чтобы проверить концентрацию бактерий, разведите 100 мкл бактериального образца в соотношении 1:10 000 и 1:100 000 в PBS. Пластина 20 мкл аликвот на агаровой пластине. Инкубировать при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе в течение 16 часов. Подсчитайте КОЕ с помощью общего исследования и рассчитайте концентрацию бактерий на следующий день.
3. Эксцизионное ранение кожи и инокуляция S. aureus
- Введите 100 мкл 0,03 мг/мл бупренорфина гидрохлорида (~0,2 мг/кг) каждой мыши путем внутрибрюшинной инъекции.
- Через двадцать минут после инъекции поместите 2-4 мышей в камеру с 2-3 LPM кислорода с 2-4% изофлураном. После того, как мыши будут полностью обезболены, переводите мышей по одной в носовой конус, подключенный к 2-3 LPM кислорода с 2-4% изофлураном. Убедитесь, что мыши полностью обезболились, сильно зажав каждую заднюю лапу между большим и указательным пальцами. Приступайте к следующему шагу, если животное не реагирует на щипки.
- Выбрейте участок размером 1 на 2 дюйма на задней стороне мыши с помощью электрических машинок для стрижки и очистите область от обрезков шерсти с помощью чистой салфетки или марли. Избегайте использования лосьона для депиляции, потому что это может вызвать чрезмерное воспаление.
- Очистите заднюю часть мыши сначала марлей, пропитанной 10% повидон-йодом, а затем марлей, пропитанной 70% этанолом. Очистите область по спирали, двигаясь наружу от центра операционной области. Подождите примерно 1 минуту, пока операционная область высохнет перед операцией.
- Свободно держите выбритую заднюю часть мыши между двумя пальцами и плотно прижмите стерильную 6-миллиметровую пробивную биопсию в центр подготовленной хирургической области. Не натягивайте кожу.
- Поверните пуансонную биопсию, чтобы создать круговой контур на коже, который полностью прорезает кожу по крайней мере на одном участке контура. Будьте осторожны, чтобы не порезать подлежащую фасцию или ткань.
- С помощью стерильных ножниц и щипцов разрежьте эпидермис и дерму по круговому рисунку, отпечатанному пункционной биопсией.
4. Инокуляция S. aureus
- Наполните инсулиновый шприц 28 г нужным биолюминесцентным бактериальным инокулянтом. В этом исследовании применяют концентрацию 1 x 108 КОЕ/мл (50 μл). Не вводите более 100 мкл объема.
- Введите 50 мкл инокулянта между фасцией и тканью в центр раны на спине мыши. Следите за тем, чтобы инокулянт образовывал пузырь в центре раны с минимальной утечкой или рассеиванием.
- Оттяните дерму в сторону, держите шприц почти параллельно ткани и медленно проталкивайте шприц в ткань до тех пор, пока не почувствуется резкое снижение сопротивления, что свидетельствует о проколе фасции. Осторожно введите шприц в центр раны и медленно выдайте инокулянт. Медленно извлеките шприц из животного.
- Вводите в раны неинфицированных животных такой же объем стерильного PBS, как описано выше.
- Верните животное в клетку. Поместите клетку под тепловую лампу или поверх грелки, и наблюдайте за животным до тех пор, пока животное не оправится от наркоза.
5. In vivo BLI и FLI
- Инициализируйте весь формирователь изображений животных с помощью программного обеспечения прибора. Обезболить мышей в камере, получающей 2-3 ЛПМ кислорода с 2-4% изофлураном. Подайте анестезию к носовым конусам внутри тепловизора.
- Поместите раненую и зараженную мышь в тепловизор. Расположите мышь таким образом, чтобы рана была как можно более ровной. Используйте следующую последовательность действий для получения изображений мышей.
- Выберите «Люминесценция» и «Фотография» в качестве режима визуализации. Время экспозиции составляет 1 минуту при малом биннинге и F/ступень 1 (люминесценция) и F/ступень 8 (фотография). Фильтр излучения открыт. Нажмите кнопку «Получить», чтобы записать изображение.
- Выберите «Флуоресценция» и «Фотография» в качестве режима визуализации. Время экспозиции составляет 1 с при малом биннинге и F/stop 1 (флуоресценция) и F/стоп 8 (фотография) с длиной волны возбуждения 465/30 нм и длиной волны излучения 520/20 нм при высокой интенсивности лампы. Нажмите кнопку «Получить», чтобы записать изображение.
- Верните животное в клетку и наблюдайте за ним до тех пор, пока оно не оправится от наркоза.
- Визуализируйте мышей ежедневно, как описано выше.
6. Анализ изображений
- Откройте изображения для количественной оценки.
- Поместите большую круглую область интереса (ROI) по всей области раны, включая окружающую кожу, для каждой мыши на изображении. Сигналы нейтрофилов in vivo FLI EGFP и сигналы in vivo BLI S. aureus выходят за пределы края раны через несколько дней и были включены в эти исследования (рисунки 2A и 2B). Щелкните Измерить ROI и запишите значения среднего потока для каждой мыши. Постройте график зависимости среднего потока каждого сигнала (p/s) от времени.
- Если требуется абсолютное количество нейтрофилов или S. aureus в ране, проведите следующие эксперименты.
- Чтобы соотнести количество нейтрофилов с сигналами in vivo FLI EGFP, ранили мышей C57BL/6J, как описано выше, и перенесли ряд нейтрофилов, полученных из костного мозга (5 x 105 до 1 x 107) от доноров LysM-EGFP или LysM-EGFPxMyD88-/- непосредственно на вершину различных ран. Изображение, как описано выше, и соотнесите сигналы in vivo FLI EGFP с известным количеством нейтрофилов.
- Чтобы коррелировать КОЕ S. aureus с сигналами BLI in vivo, ранить и инфицировать мышей, как описано выше. В 1-й день после заражения регистрируют in vivo сигналы BLI от мышей и немедленно усыпляют и охлаждают туши. Иссеките рану, гомогенизируйте ткань и нанесите бактериальные разведения на агар для ночной инкубации. На следующий день подсчитайте колонии, чтобы определить КОЕ на рану.
- Чтобы измерить заживление раны, нанесите круговой ROI на край раны, измерьте площадь раны (см2) и нарисуйте график частичного изменения от исходного уровня в зависимости от времени (рис. 2C).
