$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Индукция воспаления глазной поверхности мыши
- Проводят иммуногенную подготовку для иммунизации.
- В день иммунизации приготовьте иммуноген, смешав овальбумин (ОВА, 50 мг/мл) и коклюшный токсин (100 г/мл) в физрастворе и адъювантный гидроксид алюминия (40 мг/мл) (см. Таблицу материалов) в пропорции 1:1><.
осторожность: Проведите вскрытие, восстановление и иммуногенную подготовку коклюшного токсина в ламинарном защитном шкафу. Носите защитную одежду и избегайте любого контакта с кожей.
- Инкубировать смесь иммуногена и адъюванта при комнатной температуре в течение 30 мин и загрузить 100 мкл в шприц объемом 1 мл.
- Выполните внутрибрюшинное введение раствора иммуногена мыши, не находящейся под наркозом.
- Мягко держите мышь за хвост, держась за сетку клетки. Крепко возьмитесь за кожу спины и области шеи между большим и указательным пальцами и зафиксируйте хвост и нижние конечности между безымянным и мизинцем к ладони.
- Держите неподвижную мышь головой вниз.
- Введите 100 мкл приготовленного раствора иммуногена в правый или левый квадрант нижней части брюшной полости.
- Проведите провокационную работу с глазной поверхностью через 2 недели после иммунизации.
- Обезболить мышь изофлураном (2,5%).
- Нанесите 5 мкл OVA (50 мг/мл) или физиологического раствора (0,9 % NaCl) на каждый глаз на оба глаза и подождите, пока капля впитается в глаз. Это занимает ~5 минут.
- Повторяйте процедуру 1 раз в день в течение 7 дней.
заметка: Таким же образом может осуществляться и местное введение лекарственных препаратов.
2. Сбор глазных экссудатов
- Восстановите глазной экссудат, образовавшийся во время фазы провокационной провокации, введя 50 мкл стерильного физиологического раствора в глаз сразу после провокационной провокационной терапии.
3. Иссечение тканей глазной поверхности
- Рассеките веки и глазной шар, следуя приведенным ниже шагам.
- Усыпьте мышь путем удушья CO2 и вывиха шейки матки.
- Поместите мышь на ровную поверхность.
- Продезинфицируйте область орбиты вокруг глаза тампоном, пропитанным 70% этанолом.
- Сделайте разрез между ухом и ретроорбитальной пазухой и по поверхности над плоской костью вертикально, продлив разрез горизонтально ниже нижнего века вдоль верхнечелюстной кости и над верхним веком вдоль лобной кости. В результате образуется разрез вокруг глаза (рисунок 1).
- Осторожно удерживайте рассеченную ткань вокруг глаза с помощью изогнутых щипцов и вытяните ткань и глазное яблоко наружу.
- Поместите удаленные органы в стерильную ПБС.
- Обрежьте лишнюю мышечную ткань лица вокруг иссеченных верхних век с помощью скальпеля и под стереомикроскопом.
- Соберите конъюнктиву, выполнив следующие действия.
- Поместите верхнее веко на сухую чашку Петри под стереомикроскопом.
- С помощью тонкого пинцета и скальпеля очень аккуратно снимите беловато-слизистый слой с внутренней поверхности века.
- Затем рассеките роговицу, следуя приведенным ниже инструкциям.
- Поместите глазной глобус на новую сухую чашку Петри поверх сухого льда на 3 минуты.
- Возьмите чашку Петри на поверхность скамейки в устойчивом положении.
- Сделайте небольшой надрез на границе роговицы рядом с лимбом с помощью тонких острых ножниц.
- Продлите разрез скальпелем вокруг глазного яблока, отделяя склеру от роговицы.
- Удалите остатки радужной оболочки и хрусталика с тыльной стороны роговицы, щедро промыв солевым раствором.
