Идентификация ингибиторов киназы, которые модулируют реакцию тимоцитов на сильные сигналы TCR

Аннотация

Источник: Chen, E. W., et al. Идентификация медиаторов передачи сигналов Т-клеточных рецепторов путем скрининга библиотек химических ингибиторов. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео мы описываем метод идентификации низкомолекулярных ингибиторов киназы, которые модулируют апоптоз самореактивных CD4⁺CD8⁺ двойных положительных незрелых тимоцитов. Апоптоз индуцируется в двуположительных тимоцитах путем их активации магнитными шариками, покрытыми анти-CD3- и анти-CD28-покрытием; Затем следует лечение низкомолекулярными ингибиторами и анализ проточной цитометрии для определения того, модулируют ли ингибиторы экспрессию маркера апоптоза.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Скрининг библиотеки ингибиторов киназы (независимый от центрифуги анализ)

1. Лечение тимоцитов ингибиторами киназы
   1. Приготовьте суспензию тимоцитов.
   2. Разбавьте тимоциты в полном RPMI до получения суспензии тимоцитов в концентрации 25 x 10⁶ клеток/мл.
   3. Добавьте 40 мкл тимоцитов в каждую лунку планшета малого объема, используя многоканальную пипетку. Поставьте тарелку на лед.
   4. Разведите ингибиторы из стоковой пластины, ДМСО и дексаметазона в полном RPMI в соотношении четыре части полного RPMI к одной части ингибитора/ДМСО/дексаметазона (коэффициент разведения 5).
      заметка: Поскольку объемы, используемые в этой пластине малого объема, в 5 раз меньше, чем при традиционном методе, ингибиторы и контрольные реагенты разбавляют в пять раз перед добавлением их к тимоцитам в пластине.
   5. Добавьте 0,5 мкл ингибиторов киназы в 96-луночный планшет из соответствующих лунок ингибиторного планшета, приготовленного на шаге 1.1.4.
   6. Подготовьте восемь лунок необработанных контролей. Подготовьте четыре лунки для органов управления, обработанных транспортным средством, добавив 0,5 мкл ДМСО, приготовленного на шаге 1.1.4. Приготовьте четыре лунки 5 мкМ обработанных дексаметазоном контрольных веществ, используя разведенный дексаметазон, приготовленный на шаге 1.1.4 (рис. 1).

2. Стимуляция тимоцитов с помощью анти-CD3/CD28 гранул

1. Следите за тем, чтобы бусины были равномерно подвешены. Возьмите 1 мл бусин и промойте их 2 мл PBS. Отделите шарики с помощью магнитной подставки и аспирируйте раствор. Суспендируйте валики в 1 мл полного RPMI.
   заметка: Соотношение бусин к ячейкам составляет 1 к 2,5. Регулируйте количество бусин, в зависимости от количества лунок для стимуляции и количества используемых тимоцитов.
2. Добавьте 10 мкл суспензии в гранулах к каждому образцу, обработанному ингибитором, четырем образцам, обработанным ДМСО, и четырем из восьми необработанных образцов. Добавьте 10 мкл полного RPMI в оставшиеся четыре необработанные лунки. На рисунке 1 показана общая схема расположения табличек.
   заметка: Конечный объем скважин составляет 50 мкл, что находится в пределах максимальной емкости скважин. Важно соблюдать осторожность и держать пластины в вертикальном положении, чтобы избежать разлива через перекрестные лунки.
3. Чтобы перемешать, перемешайте пластину с помощью микропластинчатого орбитального шейкера. В качестве альтернативы можно перемешать содержимое лунок с помощью многоканальной пипетки.
4. Инкубируйте тимоциты в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 17 - 20 часов (или на ночь) с крышкой, препятствующей испарению.

3. Настройка шайбы пластин

ПРИМЕЧАНИЕ: Инструкции по настройке шайбы пластин предоставляются производителем. Эти шаги кратко описаны ниже. На каждую стадию грунтовки требуется примерно 150 мл раствора.

1. Загрунтуйте систему стирки 70% этанолом, содержащим 1% Tween 20.
2. Загрунтуйте систему промывки деионизированной водой, содержащей 1% Tween 20.
3. Загрунтуйте промывочную систему с помощью буфера для промывки FACS.

4. Окрашивание поверхностных антигенов

1. Приготовьте смесь для окрашивания антител, содержащую антитела против TCRβ, анти-CD4, анти-CD8 и анти-CD69. Разведите антитела в промывном буфере FACS в соотношении 1:100 (v/v).
2. Вымойте пластину 9 раз, используя 55 μл буфера для промывки FACS за одну промывку, используя автоматизированную систему промывки ламинарным потоком.
   заметка: По окончании промывки в каждой скважине будет 25 мкл остаточного объема.
3. Ресуспендируйте клетки в 25 мкл смеси окрашивающих антител, приготовленной на стадии 1.4.1.
4. Если образцы переносятся с 96-луночного планшета, ресуспендируйте клетки в 50 мкл смеси антител и перенесите образцы в планшет малого объема. Этот шаг соответствует способу No 2, как показано на рисунке 2А.
5. Чтобы перемешать, перемешайте планшет с помощью орбитального шейкера с микропланшетом или перемешайте образцы с помощью многоканальной пипетки и инкубируйте на льду в течение 30 минут.

5. Фиксация клеток

1. Промойте пластину 9 раз, используя 55 μл буфера для промывки FACS за одну стирку, используя автоматизированную систему промывки ламинарным потоком.
2. Добавьте буфер для фиксации/пермеабилизации (поставляется с набором для активного апоптоза каспазы-3; то же самое с 10-кратным буфером для перманентной завивки/промывки, упомянутым на шаге 1.6.1, и антителом против каспазы-3 на шаге 1.6.2) в дозе 50 μл на лунку.
3. Выдерживать на льду в течение 30 минут.

6. Внутриклеточное окрашивание для активной каспазы 3

1. Приготовьте 1x буфер для химической завивки/промывки, разбавив 25 мл 10x буфера для химической завивки/промывки в 225 мл сверхчистой воды.
2. Приготовьте внутриклеточное активное окрашивание каспазой, добавив 1 мл антитела против каспазы-3 к 2 мл 1x буфера для химической завивки/промывки. Соотношение антител к буферу для химической завивки/промывки составляет 1:2.
3. Загрунтуйте систему стирки 1x буфером для химической завивки/промывки.
4. Промойте пластину 9 раз с 1 буфером для химической завивки/промывки, по 55 мкл для каждой стирки.
5. Во все лунки добавьте 25 мкл внутриклеточного красителя каспазы, приготовленного на шаге 1.6.2.
6. Для смешивания перемешайте планшет с помощью орбитального шейкера с микропланшетом или перемешайте образцы с помощью многоканальной пипетки и выдержите на льду в течение 1 ч.
7. Промойте пластину 9 раз с 1 буфером для химической завивки/промывки, по 55 мкл для каждой стирки.
8. Добавьте во все лунки 25 мкл промывочного буфера FACS.
9. Перенесите образцы в пробирки с микротитрованием после достаточного перемешивания с помощью пипетирования.
10. Добавьте еще 50 мкл промывочного буфера FACS в пустые лунки и повторите шаг 1.6.9.
11. Повторите шаги 1.6.9 и 1.6.10 2 раза, пока 200 мкл образцов не собираются в пробирки с микротитром.
    заметка: Целью процедур, описанных в шагах 1.6.10 и 1.6.11, является обеспечение максимального восстановления клеток из пластины малого объема. Если количество клеток не вызывает беспокойства, после шага 1.6.10 просто наполните микротитровые пробирки до 200 мкл промывочным буфером FACS.
12. Проведите проточный цитометрический анализ образцов и проанализируйте результаты с помощью программы анализа FACS. Активацию каспазы-3 и экспрессию CD69 анализируют в воротах, содержащих тимоциты CD4+CD8+DP.

Результаты

Рисунок 1: Схема расположения пластин для анализа активации тимоцитов. (Вверху) Столбцы 1 и 12 зарезервированы для контроля, в то время как столбцы со 2 по 11 представляют собой обработанные ингибиторами образцы (бежевого цвета). Отрицательный контроль (нестимулированный [NS]; серый) занимает лунки от A1 до D1, а положительный контроль за гибелью клеток (обработанный дексаметазоном [DEX]; фиолетовый) занимает лунки от E1 до H1. Стол...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
РПМИ	ГиКлон	SH30027FS
ФБС	ГиКлон	SH3007103
L-глютамин	ГиКлон	SH3003401
Пируват натрия	ГиКлон	SH3023901
10-кратный PBS	Вивантис	PB0344 – 1л
Библиотека скрининга киназы (96-Well)	Кайман Кемикал	10505	Точное содержимое библиотеки может отличаться
Дмсо	Сигма Олдрич	Д2650
Дексаметазон	Сигма Олдрич	Д4902
анти-CD3/CD28 шарики	Thermo Fisher Scientific	11452Д
Набор для апоптоза FITC Active Casspase-3	BD Pharmingen	No 550480 (Английский	Содержит буфер для фиксации/пермеабилизации, 10-кратный буфер для перманентной завивки/промывки и антитела против каспазы 3
Шайба DA-Cell	КУРИОКС	ХТ1000
96-луночный планшет DA-Cell	КУРИОКС	96-ДК-КЛ-05
Антитела
CD3e	Биолегенда	100236
ТКРБ	BD Biosciences	553174
СД4	BD Biosciences	740007
СД8	BD Biosciences	563786
СД69	eBioscience	Тел.: 25-0699-42
Ингибиторы
ТГ003	Кайман Кемикал		Из библиотеки скрининга киназы
ТГ003	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПКС 412	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Doramapimod	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Паклитаксел	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Эрлотиниб	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Некростатин-5	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
НВП-БЕЗ235	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Фталазинон пиразол	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-879	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
1-НА-ПП1	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Торин 1	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Бисиндолилмалеимид II	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
БИБФ 1120	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СМИ-4а	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Бисиндолилмалеимид XI (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10657	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АС-703026	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Хлорид хелеритрина	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Туникамицин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ГСК 1059615	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Руксолитиниб	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Некростатин-1	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СБ 505124	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ЧЕРНИЛА128	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Канертиниб (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СБ 431542	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПД 173074	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Вальпроевая кислота (натриевая соль)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПД 0325901	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СБ 203580	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ВХ-702	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Эмодин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CHIR99021	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
био	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Иматиниб (мезилат)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Сунитиниб малат	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Гефитиниб	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПП2	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
3-метиладенин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Бисиндолилмалеимимид I	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Бисиндолилмалеимид IV	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Бисиндолилмалеимид V	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
НБК 663284	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Д 4476	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
НУ 7026	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
H-9 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Индирубин-3'-моноксим	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
КН-62	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
КН-93	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
КГП 57380	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Изо-Оломоуцин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
(S)-глицил-H-1152 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Бисиндолилмалеимид VIII (ацетат)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СТ638	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СУ 6656	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
LY364947	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СБ 203580 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10621	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
YM-201636	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ЗМ 447439	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АС-041164	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
NVP-AEW541 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПП242	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АБТ-869	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10622	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
17β-гидрокси вортманнина	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10626	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СУ 6668	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10572	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
N,N-диметилсфингозин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
LY294002	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
У-0126	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Ставроспорин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
KN-92 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
AS-605240 (калийная соль)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
О-1918	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Y-27632 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Лиламин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПД 98059	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПД 169316	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ТГХ-221	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
(S)-H-1152 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АС-605240	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
D-эритро-сфингозин С-18	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
OSU03012	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
JNJ-10198409	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Лиламин (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Арахидоновая кислота Лиламид	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Лауриновая кислота Лиламид	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АС-252424	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10505	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПИ-103	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПИК-75 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Ингибитор сфингозинкиназы 2	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Пицеатаннол	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПК-1	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
(R)-росковитин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
БУХТА-43-9006	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10561	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АС-604850	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
PI3-киназа α ингибитор 2	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
МЛ-9	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Трицирибин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Аналог эрбстатина	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Кенполлон	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Оломоучины	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-494	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-825	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-1478	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СБ 216763	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СБ 415286	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-17	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
H-8 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ЛФМ-А13	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СК-514	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Апигенин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-18	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10554	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ДРБ	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
РГ-13022	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
РГ-14620	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-490	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-82	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-99	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-213	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-183	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Лавендастин С	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ЗМ 336372	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
5-Йодотуберцидин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СБ 202190	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10571	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Нилотиниб	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
СП 600125	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
L-трео-сфингозин С-18	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Н-89	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
HA-1077 (гидрохлорид)	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-370	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Вортманнин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
АГ-1296	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
КТ 5823	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Янекс 1	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10574	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10575	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10576	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
НГ125	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
TWS119	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
НБК 210902	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10577	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CAY10578	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
ПД 184161	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
CCT018159	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы
Мирицетин	Кайман Кемикал	- T	Из библиотеки скрининга киназы

)