$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Выведение и активация макрофагов костного мозга антителами
- Проведите эвтаназию с использованием удушья CO2.
- Поместите мышь в индукционную камеру. Усыпите мышь с 5% изофлурановой анестезией в течение 60 - 90 с, пока она не станет неподвижной и дыхание не станет глубоким и медленным.
- Выключите изофлурановую анестезию и вводите 6–8 л/минCO2 до тех пор, пока мышь не перестанет дышать. Оставьте мышь с включенным CO2 еще как минимум на 5 минут. Убедитесь, что больше нет сердцебиения или дыхания. Выполните вывих шейки матки, чтобы обеспечить смерть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в возрасте 8 - 12 недель обеспечивают самый высокий выход макрофагов.
- Сбрызните ножки мыши 70% этанолом и прикрепите их вытянутыми в лежачем положении руками и ножками к поролоновой доске. Ножницами и щипцами для удержания кожи сделайте неглубокий надрез (0,2 см), чтобы удалить кожу и шерсть с поверхности каждой из задних лап.
заметка: Выполняют эту процедуру и все манипуляции с культурой тканей в стерильном колпаке.
- Обрежьте мышцы, чтобы были видны голени и бедренные кости. Удалите голени и бедренные кости, разрезав кость и мышцы чуть ниже тазобедренного сустава и выше лодыжек. Обрежьте как можно больше мышц.
- Сбрызните кости 70% этанолом и подождите 1 минуту, пока он испарится, затем поместите их в 6-луночную пластину с промывочной средой для костей (модифицированная среда Дульбекко от Iscove (IMDM), 10% фетальная бычья сыворотка (FBS)).
- Обрежьте концы костей, отрезав 0,1 см кости от лодыжки и верхней части бедренной кости так, чтобы костная полость была открыта. Убедитесь, что костный мозг виден, а в костную полость можно поместить иглу 26-го калибра.
- Разрежьте кости и мышцы, чтобы отделить голени и бедренные кости от коленных суставов. Введите в полость иглу 26 калибра, прикрепленную к шприцу объемом 10 мл. Промойте костный мозг в коническую пробирку объемом 50 мл с 5 мл среды для промывки костей. Промойте две голени и две бедренные кости от одной мыши в каждую трубку объемом 50 мл.
- Делайте пипетку вверх и вниз несколько раз или делайте вихревыми движениями костный мозг с медленной скоростью, чтобы аккуратно рассеять комки. Нити костного мозга должны быть разбиты на мелкие (менее 0,5 мм) пятнышки костного мозга. Заполните коническую трубку до 50 мл средой для промывки костей. Пипетку содержимое конической пробирки поместить в колбу размером 75см2, обработанную культурой тканей, и инкубировать при 37 °C, 5%CO2 в течение 1 ч.<бр/>
заметка: Зрелые макрофаги и мезенхимальные клетки прилипнут к колбе и будут отброшены, в то время как желаемые гемопоэтические предшественники останутся во взвешенном состоянии.
- Пипеткой нанесите среду с кроветворными предшественниками в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте пробирку при 300 х г при комнатной температуре в течение 5 минут. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать гранулу в 5 мл питательной среды макрофагального колониестимулирующего фактора (МЦСФ) (IMDM, 10% FBS, 5 нг/мл MCSF, 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина и 150 мкМ монотиоглицерина (MTG)).
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Добавьте среду для ресуспендирования клеток до концентрации 0,5 x 106 клеток/мл, 1,5 x 107 клеток/колбу в 30 мл среды и осторожно пипетируйте вверх и вниз. Пипетка 30 мл суспензии в новую колбу размером 75 см2 с культурой тканей.
- На 4-й и 7-й день после первоначального культивирования на шаге 1.9 убедитесь, что клетки адгезивы и слегка разветвлены, используя инвертированный фазово-контрастный микроскоп с ярким полем. Откажитесь от среды, содержащей неадгезивные клетки. Промойте клетки IMDM один раз и добавьте 30 мл питательной среды MCSF.
- Когда клетки созреют к 10-му дню (>95% положительных для F4/80 и Mac-1), еще раз убедитесь, что клетки адгезивны и незначительны.
- Для тарелирования клеток для стимуляции извлеките питательную среду из колбы и добавьте 8 мл буфера для диссоциации клеток на основе фермента ЭДТА (Таблица материалов). Инкубировать клетки в течение 5 мин при 37 °C, 5%CO2.
- Соскребите клетки аккуратно, с небольшим давлением, с помощью стерильного скребка для клеток. Проверьте в микроскоп, что клетки оторвались от поверхности колбы. Пипетка диссоциировала клетки в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте колбу 3 раза 5 мл IMDM и слейте раствор для полоскания с собранными клетками. Центрифужные ячейки при 300 х г при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в 3 мл питательной среды MCSF на коническую пробирку объемом 50 мл. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра. Ресуспендирование клеток в концентрации 1 x 106 клеток/мл и 100 мкл клеточной суспензии (1 x 105 клеток/лунка) на лунку 96-луночной тканевой культуры, обработанной плоской донной пластиной.
заметка: Из костей одной мыши будет получено достаточно клеток для 100 лунок. При желании 1 мл клеток может быть помещен в 6-луночный планшет (культура тканей обработана, плоское дно). Большее количество клеток (1 x 10,6 клеток) может быть полезно для вестерн-блоттинга.
- После прилипания стимулируйте дублирующие или тройные лунки с 10 нг/мл ЛПС в IMDM, 30 мг/мл ВПВХ или ВВИГ + ЛПС. Дозы ЛПС или ВВИГ могут быть титрованы для оптимизации ответа. Оставьте дубликаты или тройные лунки в качестве нестимулированного контроля. Инкубируйте их в течение 24 часов (37 °C, 5% CO2).
заметка: Повторно покрытые клетки должны прилипнуть к тканевым культуральным лункам в течение 1 ч.
- Соберите надосадочную жидкость клеток из каждой лунки в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл и удалите любые твердые частицы путем вращения при давлении 10 000 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость ячейки и не беспокойте гранулу. Поместите надосадочную жидкость осветленных клеток в стерильную микроцентрифужную пробирку.
заметка: Клеточные супернатанты могут быть проанализированы на цитокины, IL-10 и цитокиновую субъединицу, IL-12/23p40, с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) немедленно или хранить при температуре -80 °C в течение длительного времени. Следуйте протоколу ИФА из имеющегося в продаже набора (Table of Materials). Можно анализировать другие провоспалительные цитокины, такие как IL-6 и TNF, поскольку они также снижаются при совместном лечении стимуляцией IVIg + LPS по сравнению со стимуляцией только LPS. После стимуляции адгезивные клетки могут быть подготовлены к таким методам, как вестерн-блоттинг или количественная полимеразная цепная реакция (Q-ПЦР).