Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Вызов мышам in vivo внутривенным введением иммуноглобулина и липополисахарида (IVIg+LPS) и сбором перитонеальных макрофагов
- Взвесьте каждую мышь. Рассчитайте объем ВВИГ (исходная концентрация 100 мг/мл), необходимый для получения окончательной дозы 2,5 г/кг массы тела. Рассчитайте количество ЛПС (100 мкг/мл исходной концентрации в модифицированной среде Дульбекко (IMDM) Искова), необходимое для получения конечной дозы 0,2 мкг/г массы тела.
заметка: Например, для мыши массой 20 г требуется 500 мкл стокового раствора IVIg и 40 мкл 100 мкг/мл раствора ЛПС.
- Наберите необходимое количество ВВИГ и ЛПС в стерильный шприц объемом 1 мл, оснащенный стерильной иглой 26 калибра. Для контрольных мышей, которые не будут получать ВВИГ, замените эквивалентный объем ВВИГ стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) pH 7,4.
- Потрепайте мышь одной рукой, захватив ее кожу в задней части шеи большим и указательным пальцами, а оставшимися пальцами придерживая хвост и задние лапы. Наклоните его тело к земле.
- Поместите иглу под углом 30 - 40° относительно брюшка мыши, в правом нижнем квадранте, скосите вверх и введите на 1,5 см. Введите внутривенный иммуноглобулин + ЛПС или PBS + ЛПС внутрибрюшинно.
- Через 1 час провести эвтаназию с использованием удушения углекислым газом (CO2).
- Поместите мышь в индукционную камеру. Усыпите мышь с 5% изофлурановой анестезией в течение 60 - 90 с, пока она не станет неподвижной и дыхание не станет глубоким и медленным.
- Выключите изофлурановую анестезию и вводите 6-8 л/мин CO2 до тех пор, пока мышь не перестанет дышать. Оставьте мышь с включенным CO2 еще как минимум на 5 минут. Убедитесь, что больше нет сердцебиения или дыхания. Выполните вывих шейки матки, чтобы обеспечить смерть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши в возрасте 8 - 12 недель обеспечивают самый высокий выход макрофагов.
- Прикрепите мышь к поролоновой доске, раскинув конечности. Опрыскать детали 70% этанолом.<бр/>
заметка: Выполняют процедуру в стерильном капюшоне.
- Сделайте неглубокий надрез на коже (0,2 см) ножницами по средней линии мыши, чтобы избежать пореза брюшинной полости. С помощью щипцов снимите кожу живота живота мыши, чтобы была видна слизистая оболочка неповрежденной брюшной стенки.
- Наполните шприц объемом 5 мл 5 мл стерильного PBS (pH 7,4). Вставьте иглу 25 или 27 калибра в верхнюю часть полости с левой или правой стороны по направлению к центру мыши скосом иглы вверх.
заметка: Поместите иглу в мышь осторожно так, чтобы вы вводили PBS не в органы, а в брюшинное пространство.
- Протолкните жидкость в брюшную полость. Вытащите иглу из полости и массируйте брюшину в течение 10 с, чтобы выбить все клетки. Введите иглу в верхнюю часть полости и избегайте органов. Соберите и поместите полученную жидкость для промывания в коническую пробирку объемом 15 мл на льду.
заметка: На каждые 5 мл введенной жидкости будет восстановлено примерно 3,75 мл.
- Повторите инъекцию и восстановление (шаги 1,8 - 1,9) еще 3 раза (общий объем инъекции 20 мл), чтобы восстановить в общей сложности 15 мл жидкости для промывания. Соберите промывку от каждой мыши в отдельную коническую пробирку объемом 15 мл.
заметка: После заключительной инъекции может быть легче извлечь жидкость из крайней левой и правой сторон мыши, где скопилась жидкость. Органы будут вызывать меньше помех со стороны иглы в этом положении.
- Вращайте клетки при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите 1 мл восстановленной жидкости для промывания и используйте для анализа интерлейкина или IL-10 и IL-12/23p40 методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями производителя или заморозьте при -80 °C для будущих анализов.
заметка: Чтобы обеспечить точное сравнение между процедурами для анализа цитокинов жидкостью для лаважа, выполните 5 мл промывки брюшинной полости 4 раза для конечного объема 15 мл. Не вся жидкость будет восстановлена после каждой промывки.
- Ресуспендируйте клетки в 500 мкл гальванической среды (IMDM, 10% фетальная бычья сыворотка, FBS и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина) на каждую промытую мышь. Подсчет жизнеспособных макрофагов.
заметка: Макрофаги будут немного больше, чем другие перитонеальные клетки. Типичный выход составляет 5 x 105 - 1 x 106 макрофагов на мышь с использованием мыши дикого типа C57BL/6.
необязательный: Если в клеточной грануле присутствует большое количество эритроцитов, выполните этап лизиса в соответствии с инструкциями производителя для их удаления.
- Ресуспендируйте клетки в гальванической среде в концентрации 1 x 106 макрофагов/мл и в тарелке 100 мкл на лунку в 96-луночном планшете, обработанном культурой тканей с плоским дном.
заметка: Для эксперимента может потребоваться объединить клетки более чем одной мыши. Например, если бы одна мышь имела 5 x 105 макрофагов, потребовалось бы 500 μл гальванической среды.
- Инкубируйте клетки в течение 1 ч при 37 °C, 5%CO2, чтобы дать возможность макрофагам стать адгезивными. Адгезивными клетками являются перитонеальные макрофаги. Удалите клеточные надосадочную жидкость и неадгезивные клетки. Дважды промойте лунки 200 мкл IMDM (предварительно подогретым до 37 °C), подождите 10 секунд и медленно наклоните пластину. Замените гальванический материал. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5%CO2 в течение 30 мин до стимуляции.
- После прилипания стимулируйте дублирующие или тройные лунки с концентрацией 10 нг/мл ЛПС в IMDM, 30 мг/мл внутривенного иммуноглобулина или IVIg+LPS. Дозы ЛПС или ВВИГ могут быть титрованы для оптимизации ответа. Оставьте дубликаты или тройные лунки в качестве нестимулированного контроля. Инкубируйте их в течение 24 часов (37 °C, 5% CO2).
заметка: Повторно покрытые клетки должны прилипнуть к тканевым культуральным лункам в течение 1 ч. Образцы можно использовать сразу или заморозить и хранить при температуре -80 °C для анализа цитокинов методом ИФА.
- Соберите надосадочную жидкость клеток из каждой лунки в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл и удалите любые твердые частицы путем вращения при давлении 10 000 x g в течение 5 минут.
- Удалите надосадочную жидкость ячейки и не беспокойте гранулу. Поместите надосадочную жидкость осветленных клеток в стерильную микроцентрифужную пробирку.
заметка: Клеточные надосадочные жидкости могут быть проанализированы на цитокины, IL-10, и субъединицу цитокинов, IL-12/23p40, с помощью ИФА немедленно или храниться при температуре -80 °C в течение длительного времени. Следуйте протоколу ИФА из имеющегося в продаже набора (Table of Materials). Можно анализировать другие провоспалительные цитокины, такие как IL-6 и фактор некроза опухоли (TNF), поскольку они также снижаются при совместном лечении стимуляцией IVIg+LPS по сравнению со стимуляцией только ЛПС. После стимуляции адгезивные клетки могут быть подготовлены к таким методам, как вестерн-блоттинг или количественная полимеразная цепная реакция (Q-ПЦР).
