Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Иммунизация мышей
- Приготовьте основную смесь вакцин в стерильном физиологическом буфере, таком как физраствор или DPS.
заметка: Общий объем в смеси должен включать на 10% больше, чем требуется для иммунизации всей группы. Концентрации вакцинной композиции подробно описаны ниже в шагах 1.1.1 и 1.1.2. Транспортируйте вещи в виварий на льду.
- Для исследований B. pertussis включите следующие группы вакцин: бесклеточная коклюшная вакцина (aPV) и aPV + фактор колонизации Bordetella A (BcfA). Кроме того, в качестве контрольных групп следует использовать квасцы, только вакцинные антигены (нитчатый гемагглютинин (FHA) и пертактин (Prn)), а также наивных (неиммунизированных) мышей><.
ПРИМЕЧАНИЕ: aPV составляет 1/5 человеческой дозы одобренного FDA aPV, который состоит из столбнячного анатоксина, восстановленного дифтерийного анатоксина, коклюшного анатоксина (PT), филаментозного гемагглютинина (FHA) и пертактина (Prn), адсорбированных к солям алюминия. Одна человеческая доза текущего коклюша aPV составляет 0,5 мл, следовательно, 1/5 часть дозы составляет 0,1 мл. Объемы для aPV + BcfA составляют 0,1 мл aPV (1/5 от человеческой дозы) + 0,046 мл BcfA (30 мкг) на мышь. Максимальный объем, который можно безопасно доставить в одну мышцу, составляет 0,1 мл. Поскольку объем вакцины aPV + BcfA превышает 0,1 мл, вакцина должна быть доставлена в оба плеча, разделенные примерно поровну, чтобы ее можно было безопасно ввести.
- Для приготовления экспериментальной вакцины для получения одной дозы соедините 1 г FHA и 0,5 μг Prn с 50 μг геля гидроксида алюминия в стерильном PBS. Дайте экспериментальному aPV перемешаться на лабораторном валике в течение 15 минут при комнатной температуре (RT). После этого вращайте пробирку при давлении 18 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте содержимое в 1 мл стерильного PBS.
- В виварии установите наркозный аппарат (Рисунок 1).
заметка: Перед использованием убедитесь, что в соответствующих баллонах имеется достаточный уровень кислорода и изофлурана. Взвесьте канистру с изофлураном и замените ее, когда ее вес увеличится на 50 г.
- Тщательно очистите шкаф биологической безопасности (БСК) и поместите чистую индукционную камеру внутрь БСК. Подсоедините трубопроводы для анестезии и продувки от наркозного аппарата к индукционной камере. Откройте кислородный баллон с помощью регулятора, чтобы убедиться в потоке кислорода, и установите уровень 1,5-2 л/мин.
- Поместите мышей желаемого возраста (6-12 недель) в индукционную камеру. Включите изофлуран до 2,5-3% для того, чтобы слегка обезболить мышей. Следите за животными до тех пор, пока они не перестанут двигаться в камере и их дыхание не замедлится.
- Проверьте уровень индукции, сжимая пальцы ног, наблюдая за любым рефлекторным движением. Если его нет, то мыши готовы к инъекции.
Примечание: В этом эксперименте вся клетка с животными была обезболена одновременно. Можно выбрать обезболивание животных по отдельности для инъекций или инъекции без анестезии. Подходит любой из этих способов.
- Тем временем приготовьте 1 мл инсулиновых шприцев (28G1/2) с 0,1 мл вакцины каждый. Когда животные будут полностью индуцированы, удалите одно животное из камеры и положите мышь вентрально на полотенце или скамейку.
- Вводите вакцину внутримышечно. С помощью шприца под углом 45° и скосом вверх введите шприц на ~5 мм в дельтовидную мышцу мыши и введите вакцину.
заметка: Задняя четверть/бок могут быть использованы в качестве места инъекции вместо дельтовидной.
- После инъекции держите иглу введенной в мышцу в течение ~5-10 с. После подачи объема поверните шприц на 180° так, чтобы скос был обращен в сторону, чтобы создать уплотнение и предотвратить утечку вакцины. Затем медленно вытяните иглу из места инъекции.
- Верните мышь в клетку. Повторите процедуру со всеми животными в обозначенной группе.
- Выключите изофлуран и промойте индукционную камеру кислородом перед обезболиванием очередной клетки мышей.
- Следите за животными до тех пор, пока все они не станут бдительными и не начнут двигаться в клетке. Верните клетку на место размещения.
- Наблюдайте за животными каждые 12 ч после вакцинации, до 48 ч, на предмет клинических симптомов заболеваемости, таких как грубая/неопрятная шерсть, медленная походка или затрудненное дыхание. Если симптомы не исчезают, проконсультируйтесь с ветеринаром учреждения и при необходимости исключите мышей из исследования.
- Через четыре недели после первоначальной иммунизации усильте мышей путем обезболивания и внутримышечных инъекций в правую дельтовидную мышцу мыши с той же вакциной, которая была введена ранее.
- Опять же, следите за животным на предмет любых клинических симптомов. Задержите животных еще на 2 недели, а затем приступайте к заражению.
2. Модель интраназальной инфекции у мышей
- В виварии установите условия для кислорода и анестезии, как описано в шагах 1.3 и 1.4. Как описано в шаге 1.5, поместите мышей в камеру для обезболивания. Наблюдайте за животными до тех пор, пока анестезия не начнет действовать.
- Когда мыши будут обезболены, удаляйте по одному животному из индукционной камеры. Возьмите мышь в руки за загривок спинной грудной клетки, за лопатками и шеей. Расположите мышь вертикально, чтобы получить доступ к носу.
- С помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл медленно нанесите 40-50 мкл бактериального инокулюма B. pertussis на ноздри мыши (по 20-25 мкл на каждую ноздрю). Держите мышь до тех пор, пока животное не вдохнет весь инокулюм. Если часть инокулюма пузырится, соберите пузырьки и снова закапывайте их в ноздри. Дайте равное количество стерильного PBS одной группе мышей в качестве отрицательного контроля.
- Как и в пунктах 1.10-1.12, верните привитых животных в клетку и наблюдайте за животными до тех пор, пока они не насторожятся и не начнут двигаться. Верните клетку на исходное место на стойке. Промойте индукционную камеру кислородом, чтобы удалить остаточный изофлуран, прежде чем обезболить следующую группу животных. Наблюдение за животными в течение 48 ч после заражения.
- В лабораторных условиях проводится последовательное разведение инокулюма в стерильных PBS для проверки фактических колониеобразующих единиц (КОЕ), доставленных мышам. Планшет 0,1 мл разведений на 10% BG+Sm планшетах (агаровые планшеты Bordet-Gengou с добавлением 10% дефибринированной овечьей крови и 100 мкг/мл стрептомицина) (рис. 2А). Поместите пластины в инкубатор с температурой 37 °C и выращивайте в течение 4 дней. Подсчитайте и рассчитайте КОЕ из инокулюма, подаваемого мыши (рисунок 2B).
3. Забор тканей животных после инфекции
- Подготовьтесь к вскрытию мышей и забору тканей.
- Простерилизуйте все инструменты (ножницы грубого и тонкого помола, изогнутые ножницы, тонкие щипцы, пестики для гранул и треугольные разбрасыватели), необходимые для обработки тканей в автоклаве. Запечатайте инструменты в пакеты для стерилизации. Оберните стекло гомогенизатора в фольгу и заклейте автоклавной лентой для обозначения стерильности.
- Подготовьте агаровые пластины за 1 или 2 дня до забора ткани, чтобы убедиться, что пластины затвердели перед использованием. Для B. pertussis используйте 10% BG + Sm. Этикеточные пластины для легкого для каждой мыши с желаемыми разведениями, определенными опытным путем для каждого эксперимента.
- Наполните и пробирки для разбавления КОЕ. Добавьте 0,9 мл стерильного PBS в стерильные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл в зависимости от количества обрабатываемых органов и разведений на орган.
- Наполнение и маркировка пробирок для сбора салфеток:
- Легкие: добавить 2 мл стерильного 1% казеина в PBS в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл и хранить при температуре 4 °C. Чтобы собрать легкие для гистологии, добавьте 2 мл 10% нейтрального буферизованного формалина (НБФ) и храните его в режиме лучевой терапии.
- Свежий 70% этанол должен быть подготовлен для наполнения мензурок и пульверизаторов для вскрытия.
- Перевезите все материалы в виварий на тележке в день сбора урожая. Очистите ДСК и установите наркозный аппарат, как показано в шагах 1.3 и 1.4.
- Поместите мышей, подлежащих препарированию, в индукционную камеру и, при поступлении кислорода, включите изофлуран до 5% и подождите, пока животные не потеряют сознание. Удаляйте мышей по одной и вывихивайте животное в качестве вторичного метода для обеспечения смерти. После вывиха шейки матки эвтаназия должна быть подтверждена отсутствием частоты дыхания и/или отсутствием рефлекса отмены (тест на защемление пальца ноги).
- Расположите мышь подфюзеляжной стороной вверх на доске для вскрытия и раздвиньте руки и ноги. Распылите на тело мыши 70% этанола.
- С помощью щипцов обхватите кожу ниже живота, в центре таза. С помощью острых ножниц сделайте вертикальный надрез до нижней челюсти. Затем рассеките кожу от стенки брюшины, раздвинув два слоя небольшими движениями с закрытыми ножницами. Поместите кожу по бокам туши, чтобы создать беспрепятственное поле для стерильного забора органов.
- С помощью щипцов стабилизируют грудную клетку в области мечевидного отростка и разрежьте диафрагму. Легкие должны сдуваться и опускаться к позвоночнику. Разрежьте грудную клетку по бокам, чтобы удалить нагрудник.
- Изолируйте и удалите верхнюю долю правого легкого, перерезав легочные артерии и вены. Поместите долю в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 10% NBF, и поместите трубку в режим RT не менее чем на 24 часа, чтобы зафиксировать ткань. Изолируйте оставшиеся доли правого легкого и левого легкого. Поместите доли в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл 1% казеина в PBS, и положите ее на лед.
- Утилизируйте тушу в пакете с биологической опасностью. Перед тем как препарировать очередное животное, промойте инструменты деионизированной водой, а затем поместите их в стакан, наполненный 70% этанолом. Извлеките инструменты, стряхните излишки этанола, а затем приступайте к следующему вскрытию.
- Препарируйте каждую мышь, следуя инструкциям, упомянутым выше.
- Обработайте ткани, как описано ниже.
4. Обработка легких
- Перенесите легкие (в 2 мл 1% казеина в PBS) в стерильный гомогенизатор Dounce объемом 15 мл. Используйте пестик для гомогенизации тканей. Диссоциируйте до тех пор, пока не останутся крупные частички ткани. Поместите гомогенизированную суспензию обратно в исходную пробирку объемом 15 мл.
- Удалите аликвоту объемом 0,3 мл для покрытия КОЕ и центрифугируйте гомогенат при 450 x g в течение 5 мин при 4 °C. Соберите и распределите надосадочную жидкость в 0,5 мл аликвот в предварительно маркированные микроцентрифужные пробирки. Образцы хранят при температуре -20 °C до анализа цитокинов методом ИФА.
- Выбранные разведения готовят путем последовательного разведения 0,1 мл гомогенизированной легочной суспензии в разводящих пробирках (0,9 мл стерильного PBS). Нанесите 0,1 мл эмпирически подобранных разведений на предварительно помеченные 10% BG+Sm планшеты и распределите с помощью стерильного треугольного распределителя.
- Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C на комнатном воздухе в течение 4 дней.
- Подсчитайте и рассчитайте КОЕ/легкие (Рисунок 3). Вкратце, умножьте восстановленные номера КОЕ на коэффициент разведения пластины, а затем также на общий объем, в котором был обработан орган. Затем расчеты КОЕ преобразуются в значения Log10 для каждого животного и отображаются на графике.
- Пластины с 30-300 колониями легко и точно подсчитываются. Пластины с менее чем 6 колониями не следует использовать для расчетов, так как такое низкое количество колоний вносит ошибки. Чтобы получить нижний предел обнаружения, общий объем, в котором орган был гомогенизирован, делят на объем, использованный для нанесения на планшет неразбавленного гомогената (например, 2 мл общего объема, разделенного на 0,1 мл неразбавленного гомогената, равны нижнему пределу в 20 КОЕ, которые можно обнаружить).
