ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были выполнены с использованием В-клеток IIA1.6.
1. Активация В-клеток с помощью гранул, покрытых антигеном
- Приготовление гранул, покрытых антигеном
- Для активации В-клеток используютNH-2-гранулы, ковалентно покрытые антигеном (Ag-покрытые бусины), которые получают с использованием 50 μL (~20 x 106 шариков) 3 μmNH-2-гранул с активирующими (BCR-лиганд+) или неактивирующими (BCR-лиганд-) антигенами.
- Для IIA1.6 B-клеток используют анти-IgG-F(ab')2 фрагмент в виде BCR-лиганда+ и анти-IgM-F(ab')2 или бычий сывороточный альбумин (BSA) в качестве BCR-лиганда. Для активации первичных В-клеток или IgM+ В-клеточной линии используйте анти-IgM-F(ab')2 в качестве BCR-лиганда+ и BSA в виде BCR-лиганд-.
заметка: Чтобы избежать связывания лигандов с Fc-рецептором, вместо полноразмерных антител используют фрагменты антител F(ab') или F(ab')2.
- Чтобы приступить к приготовлению гранул с покрытием Ag, поместите гранулы в микроцентрифужные пробирки с низким связыванием белков, чтобы максимизировать извлечение гранул во время манипуляций с образцом. Добавьте 1 мл 1x фосфатно-солевого буфера (PBS) для промывки шариков и центрифугируйте при 16 000 x г в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость.
- Суспендируйте шарики 500 μл 8% глутаральдегида для активации групп NH2 и вращайте в течение 4 часов при комнатной температуре (RT).
осторожность: Исходный раствор глутаральдегида следует использовать только в химическом вытяжном шкафу. Следуйте инструкциям в паспорте безопасности материала (MSDS).
- Центрифугируйте шарики при 16 000 x g в течение 5 минут, удалите глутаральдегид и промойте шарики еще три раза 1 мл 1x PBS.
осторожность: Раствор глутарового альдегида следует выбрасывать как опасные химические отходы.
- Ресуспендируйте активированные шарики в 100 мкл 1x PBS. Образец можно разделить на две микроцентрифужные пробирки с низким связыванием белков: 50 мкл для BCR-лиганда+ и 50 мкл для BCR-лиганда.
- Для приготовления раствора антигена используют две микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл с низким связыванием белков, содержащие 100 мкг/мл раствора антигена в 150 мкл PBS: одну пробирку с BCR-лигандом+, а другую с BCR-лигандом-.
- Добавьте 50 μL раствора активированных гранул в каждую пробирку, содержащую 150 μL раствора антигена, вортекс и вращайте в течение ночи при 4 °C.
- Добавьте 500 мкл 10 мг/мл BSA, чтобы заблокировать оставшиеся реактивные группы NH2 на шариках, и вращайте в течение 1 часа при 4 °C.
- Центрифугируйте гранулы при давлении 16 000 x g в течение 5 минут при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Вымойте бусины холодным 1x PBS еще три раза.
- Ресуспендируйте активированные шарики в 70 мкл 1x PBS.
- Чтобы определить конечную концентрацию гранул с покрытием Ag, разведите небольшой объем бусин в PBS (1:200) и подсчитайте с помощью гемоцитометра. Затем хранить при температуре 4 °C до использования.
заметка: Бусины с покрытием Ag не должны храниться более 1 месяца.
2. Приготовление покровных листов из поли-L-лизина
- Перед проведением анализа активации В-клеток с помощью гранул с покрытием Ag приготовьте покровные стекла, покрытые поли-L-лизином (PLL-coverslips). Используйте пробирку объемом 50 мл, содержащую 40 мл 0,01% мас.% раствора ФАПЧ, и погрузите в раствор покровные стекла диаметром 12 мм. Ротация на ночь в RT.
- Промойте покровные стекла с помощью 1x PBS и дайте высохнуть на 24-луночной крышке, покрытой парафиновой пленкой. Приступайте к активации В-клеток.
3. Активация В-клеток
- Чтобы начать активацию В-клеток с помощью гранул, сначала разведите В-клеточную линию IIA1.6 до 1,5 x 106 клеток/мл в среде CLICK (RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-аланин-L-глутамина + 55 мкМ бета-меркаптоэтанола + 1 мМ пирувата + 100 Ед/мл пенициллина + 100 мкг/мл стрептомицина) + 5% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки [FBS]).
- Соедините 100 мкл (150 000 клеток) IIA1.6 B-клеток с гранулами с покрытием Ag в соотношении 1:1 в пробирках объемом 0,6 мл. Аккуратно перемешайте с помощью вихря и высадите семена на PLL-покровные листы. Инкубируйте в различные моменты времени в инкубаторе для клеточных культур (37 °C / 5%CO2). Типичные временные точки активации — 0, 30, 60 и 120 минут. Для времени 0 поместите покровные стекла ФАПЧ в 24-луночную крышку планшета на льду. Добавьте смесь шариков, покрытых Ag-покрытием, и выдерживайте 5 минут на льду.
заметка: Важно перемешивать вихревым способом, а не пипетировать вверх и вниз, потому что это может уменьшить количество шариков в образце из-за их накопления в пластиковом наконечнике пипетки. Используйте шарики, покрытые BCR-лигандом, в качестве отрицательного контроля для каждого анализа. Мы рекомендуем сначала активировать самое длительное время инкубации, а затем следующие временные точки. Рассчитайте интервалы активации образцов таким образом, чтобы они были готовы к фиксации в одно и то же время.
- Добавьте 100 мкл холодного 1x PBS в каждый покровный лист, чтобы остановить активацию и продолжить выполнение протокола иммунофлюоресценции.
