Активация В-клеток на покровном стекле, покрытом антигеном

Аннотация

Источник: Ibañez-Vega, J., et al., Изучение динамики органелл в В-клетках во время формирования иммунных синапсов. J. vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует активацию В-клеток in vitro. Процесс включает в себя взаимодействие антигена с рецепторами В-клеток, что приводит к ремоделированию цитоскелета, образованию иммунных синапсов, движению лизосом, интернализации антигена, обработке и последующей презентации на молекулах MHC для активации В-клеток.

Протокол

1. Получение покровных листов из поли-L-лизина

1. Перед проведением анализа активации В-клеток с помощью гранул с покрытием Ag приготовьте покровные стекла, покрытые поли-L-лизином (PLL-coverslips). Используйте пробирку объемом 50 мл, содержащую 40 мл 0,01% мас.% раствора ФАПЧ, и погрузите в раствор покровные стекла диаметром 12 мм. Ротация на ночь в RT.
2. Промойте покровные стекла с помощью 1xPBS и дайте высохнуть на 24-луночной крышке, покрытой парафиновой пленкой. Приступайте к активации В-клеток.

2. Активация В-клеток на покровных стеклах, покрытых антигеном

1. Приготовление покровных покрытий с антигенным покрытием
   1. Перед активацией приготовьте раствор антигена (1x PBS, содержащий 10 мкг/мл BCR-лиганд+ и 0,5 мкг/мл крысиного антимышиного CD45R/B220).
   2. ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность подготовки покровных листов за день до анализа. B220 улучшает адгезию В-клеток, однако BCR-Ligand+ достаточно для генерации реакции на растекание.
   3. Поместите покровное стекло диаметром 12 мм на 24-луночную крышку, покрытую парафиновой пленкой, добавьте 40 μл раствора антигена на каждую защитную крышку и инкубируйте при температуре 4 °C в течение ночи. Закройте пластину во избежание испарения раствора антигена.
   4. Вымойте покровные стекла с помощью 1x PBS и высушите на воздухе.
2. Активация В-клеток
   1. Чтобы начать активацию, разведите IIA1.6 B-клетки до 1,5 x 10⁶ клеток/мл в среде CLICK + 5% FBS.
   2. Добавьте 100 мкл клеток на покровное стекло, покрытое антигеном (Ag-coverslip) и активируйте в различные моменты времени в клеточном инкубаторе при температуре 37 °C / 5%_CO2. Типичные временные точки активации: 0, 30 и 60 мин.<бр/> заметка: Как и в разделе 1, мы рекомендуем начинать с самого длинного момента активации, чтобы зафиксировать все образцы одновременно.
   3. Для времени 0 поместите 24-луночную крышку планшета, содержащую Ag-coverslip, на лед и добавьте ячейки. Выдерживать 5 минут на льду.
   4. Осторожно отсасывайте среду на каждом Ag-coverslip, а затем добавьте 100 μL холодного 1x PBS, чтобы остановить активацию.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
IIA1.6 (вариант A20) клетки B-лимфомы мыши	АТКС	ТИБ-208	Мышиная В-клеточная лимфома происхождения Balb/c, экспрессирующая на своей поверхности IgG-содержащий BCR без FcγIIR
CaCl2	Уинклер	СА-0520
глицин	Уинклер	БМ-0820
HyClone Фетальная бычья сыворотка	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03	Нагрев выключить при 56 °C на 30 мин
KCl	Уинклер	ПО-1260
NaCl	Уинклер	СО-1455
Парафильм	М	П1150-2
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140122	жидкость
Поли-L-лизин	сигма	П8920	Разбавить стерильной водой
РПМИ-1640	Биологическая промышленность	01-104-1А
Пируват натрия	Thermo Fisher Scientific	11360070
Туба 50 мл	Корнинг	353043
2-меркаптоэтанол	Thermo Fisher Scientific	21985023
глутамин	Thermo Fisher Scientific	35050061
Антитела IgG против мышей	Иммуноисследования Джексона	315-005-003	IIA1.6 положительный лиганд