Влияние антитела Anti C-fms на остеокластогенез в клетках костного мозга мышей in vitro

Аннотация

Источник: Marahleh, A., et al. Влияние антитела против c-fms на образование остеокластов и пролиферацию предшественника остеокластов in vitro. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем влияние различных концентраций антител против c-fms на остеокластогенез, который представляет собой процесс образования остеокластов из предшественников остеокластов.

Протокол

1. Генерация BMM

1. Высадите 1 x 10⁷ клеток/10 мл в чашку для культивирования 10 см и добавьте M-CSF 100 нг/мл. Конечная концентрация М-КСФ составляет 100 нг/мл питательной среды. Инкубировать культуру при 37 °С, 5%_СО2 в течение 3 дней.
2. Через 3 дня удалите питательную среду, энергично промойте клетки 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) два раза для удаления неадгезивных клеток, добавьте 5 мл 0,02% трипсина-ЭДТА комнатной температуры в PBS и инкубируйте при 37 °C, 5%_CO2 в течение 5 минут.
3. Отделите клетки путем тщательного пипетирования. Убедитесь, что клетки были отделены, наблюдая за культурой под микроскопом (клетки должны казаться округлыми и плавающими в средах). Если клетки остаются прикрепленными, тщательно повторите пипетирование, чтобы отделить их. Когда клетки будут отделены, добавьте 5 мл α-MEM, чтобы инактивировать реакцию.
4. Соберите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте 5 мл α-MEM.
5. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин и ресуспендируйте гранулу в 10 мл α-МЭМ.
6. Выполните подсчет ячеек.
7. Высадите 1 x 10⁶ клеток/10 мл в чашку для культивирования 10 см и добавьте M-CSF 100 нг/мл. Конечная концентрация М-КСФ составляет 100 нг/мл питательной среды. Инкубировать культуру при 37 °С, 5%_СО2 в течение 3 дней.

2. Генерация остеокластов из BMM в качестве предшественников остеокластов

1. Через 3 дня соберите прикрепленные клетки, которые представляют собой BMM в качестве предшественников остеокластов, следуя шагам 1.2-1.7.
2. Затравите BMM в 5 x 10⁴ ячейки/200 мкл α-MEM в 96-луночном планшете. Добавьте RANKL для конечной концентрации 50 нг/мл или TNF-α для конечной концентрации 100 нг/мл. Добавьте M-CSF до конечной концентрации 100 нг/мл в каждую лунку.
3. Добавьте антитела anti-c-fms (конечные концентрации 0, 1, 10, 100, 1000 нг/мл) в каждую лунку.
4. Инкубировать при 37 °C, 5% CO₂ в течение 4 дней. Меняйте носители через день в течение 4 дней.

3. Окрашивание тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP)

1. После 4 дней инкубации аккуратно отсасывайте питательную среду из каждой лунки. Промойте каждую лунку один раз 200 μл комнатной температуры 1x PBS.
2. Добавьте 200 мкл 10% формалина в каждую лунку для фиксации и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. Отсадите формалин и промойте каждую лунку 3 раза деионизированной водой.
3. Добавьте 200 мкл 0,2% Triton X-100 в PBS в каждую лунку для пермеабилизации и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре. Отсадите Triton X-100 и промойте каждую лунку 3 раза деионизированной водой.
4. Добавьте в каждую лунку по 200 мкл раствора для окрашивания TRAP. Визуализируйте пятно под микроскопом. Потребуется от 10-30 минут, чтобы пятно правильно развилось
5. Отсадите пятно и промойте каждую лунку деионизированной водой 3 раза, а затем высушите на воздухе. Держите его при комнатной температуре, чтобы использовать в дальнейшем наблюдении.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Антитела против c-Fms			AFS98, моноклональное антитело к материнской матери, c-Fms антитела (IgG2a)
РАНКЛ	ПЕПРОТЕХ	315-11	Рекомбинантный мышиный лиганд sRANK, источник: E.coli
М-КСФ			Рекомбинантный человеческий M-CSF. 1/10 об. супернатанта культуры клеточной линии CMG14–12 в 5X106 клетках в 10-сантиметровой чашке для культуры суспензии.
α-MEM	Вако		с L-глютамином и феноловым красным
Фетальная бычья сыворотка	Биозапад	С1820-500	Фетальная бычья сыворотка французского происхождения
Блюдо из культуры	Корнинг		Тарелка 100 мм x 20 мм
96-луночный планшет	Thermofisher Scientific		Монахиня клон Дельта поверхность