1. Вирусная инфекция у дрозофил
- Заражайте мух с помощью наноинъекций и проводите анализы выживаемости.
- Потяните за капилляры, чтобы подготовить инъекционные иглы, заполните инъекционную иглу маслом и соберите инжектор.
- Обезболивающие мухи на прокладке под действием легкого потокаСО2. Инокулировать мух путем внутригрудного введения 50,6 нл раствора вируса (100 БОЕ, разбавленных буфером Tris-HCl, pH 7,2). Введите не менее 3 флаконов с мухами (по 20 мух на флакон).
заметка: Инъекция занимает много времени (обычно 100 мух в час), а репликация вируса дрозофилы C (DCV) происходит очень быстро, поэтому очень важно записывать точное время на пробирке после окончания каждого флакона (20 мух). Внедрение только буфера устанавливается в качестве фиктивного элемента управления. Как правило, предпочтение отдается взрослым самцам мух, так как результаты более стабильны и воспроизводимы, чем при использовании самок, поскольку гормональные изменения во время спаривания и размножения могут влиять на показания самок.
- Выращивайте инъекционных мух при температуре 25 °C, влажности 60% при нормальном цикле света/темноты. Ежедневно снабжайте мух свежим кормом, и фиксируйте количество мертвых мух.
- Выполните не менее 3 биологических повторений и постройте кривую выживаемости.
- Для статистического анализа данных о выживаемости сгенерируйте кривые выживаемости Каплана-Мейера с помощью статистического программного обеспечения. Выполните логарифмический ранговый тест для вычисления значений P. В таблицу выживаемости введите информацию по каждому испытуемому. Затем программное обеспечение вычисляет процент выживаемости в каждый момент времени и строит график выживаемости Каплана-Мейера.
заметка: НЕ добавляйте в флакон дополнительные дрожжи. По сравнению с контрольной группой, инфицированные DCV мухи иногда имеют асцит и неуклюжи, что делает их уязвимыми к липким дрожжам. В предварительном эксперименте лучше записать больше временных точек, чтобы выяснить временные рамки, в которые произойдет массовая гибель инфицированных мух. Как правило, инфицированные мухи редко умирают в течение первых двух дней, даже для мутантных линий Dicer-2. Для мухи w1118 (Bloomington 5905), инфицированной 100 БОЕ DCV, это временное окно составляет около 3-5 дней после заражения. Плодовые мушки, которые умирают в течение 0,5 ч после инъекции, не должны считаться смертельными, потому что они могут быть убиты от травмы иглой, а не от вирусной инфекции.
2. Измерение нагрузки DCV с помощью анализа цитопатического эффекта (CPE)
- В 1-й день заражайте самцов мух, как описано в шагах 1.1.1-1.1.2. Сгруппируйте инъекционных мух в группы по 20 человек и поддерживайте их на свежем корме для мух в течение желаемого времени (обычно в течение 24 часов или 3 дней). Ежедневно обеспечивайте мух свежим кормом.
- На 2-й день высейте клетки Drosophila S2* в 10-сантиметровую чашку для клеточной культуры до плотности примерно 5x106 до 1x107 клеток/мл.
- На 3-й день соберите 5 мух (под легким потокомСО2) и измельчите их в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл в течение 30 с 200 мкл трис-буфера и керамических шариков с помощью гомогенизатора. Храните образцы при температуре -80 °C или сразу переходите к следующему этапу.
- Тщательно обработайте образец вихрем. С помощью шприца объемом 1 мл и фильтра 0,22 мкм отфильтруйте надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 мл.
- Проводят последовательные 10-кратные разведения надосадочной жидкости с полной средой для клеток S2*. Добавьте в лунку разведение по 50 μл. Добавьте 50 мкл питательной среды без вируса в лунку, классифицируемую как лунка отрицательного контроля.
заметка: Для каждой степени разубоживания использовали 8 скважин. Поскольку типичный выход DCV составляет около 108-10 9 БОЕ/мл, разведение должно охватывать, по крайней мере, ~10-5-10-10.
- На 4-й день наблюдайте за CPE с помощью светлопольного микроскопа с объективом 20X или 40X. Классифицируйте лунку, в которой клетки выглядят размытыми, а среда заполнена фрагментами, как «положительную лунку», а лунку, в которой морфология клеток нормальная, — как «отрицательную лунку».
- Пометьте положительные или отрицательные скважины CPE знаком + или –, соответственно. Рассчитайте среднюю инфекционную дозу вирусной культуры тканей (TCID50).
3. Нагрузка DCV, измеренная с помощью qRT-PCR
- В 1-й день заражайте мух, как описано выше. Группируйте самцов мух (20 мух в группе) и выращивайте их на свежем корме для мух в течение желаемого времени, обычно в течение 24 часов или 3 дней. Ежедневно обеспечивайте мух свежим кормом.
- На 3-й день соберите 5 мух под световым потоком CO2 в пробирку объемом 1,5 мл с 200 мкл буфера для лизиса и 20 керамическими шариками (диаметр = 0,5 мм) и измельчите образцы с помощью гомогенизатора с высокой скоростью в течение 30 с. Добавьте в каждую пробирку по 800 мкл дополнительного буфера для лизиса и храните образцы при температуре -80 °C или немедленно проведите экстракцию РНК и qRT-PCR.
- Приготовьте наконечники, трубки, пробирки, не содержащие РНКазы, а также деионизированную, обработанную диэтилпирокарбонатом (DEPC) и отфильтрованную мембраной 0,22 мкм воду. Добавьте в образец 200 μл хлороформа (≥99,5%) и энергично встряхивайте в течение 15 с вручную. Инкубировать в течение 5 минут или дольше при комнатной температуре до тех пор, пока водная фаза и органическая фаза не будут четко разделены.
заметка: Хлороформ чрезвычайно опасен, и с ним нужно обращаться осторожно. НЕ делайте образец вихревыми, это увеличит риск загрязнения ДНК.
- Центрифугируйте образцы при 13 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- Соберите 400 мкл надосадочной жидкости и перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки. Смешайте с таким же объемом изопропанола (≥ 99,5%), аккуратно переверните образцы 20 раз вручную, а затем высадите в осадок в течение 10 минут или дольше при комнатной температуре><.
заметка: Осадки при -20 °C увеличат выход РНК.
- Центрифугируйте образцы при давлении 13 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. На дне пробирки видны гранулы белой РНК.
- Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 1 мл 70% этанола (этанол в воде DEPC) и переверните несколько раз, чтобы промыть РНК.
- Центрифугируйте образцы при 13 000 x g в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и сухую РНК в течение 5-10 мин; РНК должна стать прозрачной.
- Добавьте в образец 50 μл воды DEPC, несколько раз пипетку и сделайте вихрь.
- Возьмите 3 мкл РНК для титрования концентрации РНК. Количественное определение РНК при длине волны 260 нм. В норме концентрация РНК, экстрагируемой по этому протоколу, составляет примерно 100-500 мкг/мкл, что подходит для синтеза кДНК.
- Используйте 2 мкг РНК для синтеза кДНК. Разбавьте образец до 100 мкл с ddH2O и храните при -20 °C.
- Проведите qRT-PCR в соответствии с инструкциями производителя и запустите qRT-PCR.
заметка: Для синтеза кДНК DCV случайные праймеры работали гораздо лучше, чем полиА-праймеры. Экспрессия мРНК DCV нормализуется до эндогенной мРНК рибосомального белка 49 (rp49). Олигонуклеотидные праймеры, используемые в этой части:
rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (вперед) и
5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (реверс);
DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (вперед) и
5' CGCATAACCATGCTCTCTG 3' (реверс);
vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (вперед) и<бр />
5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (задний ход);
вирус-индуцированная РНК 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (вперед) и
5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (задний ход).
