$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Выделение моноцитов человека и дифференцировка в макрофаги
- Получите антикоагулянтную кровь от обезличенных здоровых лиц в региональном банке крови и выделите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), как указано ниже.
заметка: Выполняйте все этапы в культуре тканей ламинарным вытяжным шкафом. Используйте только стерильные пробирки и надевайте перчатки. Добавляйте 10% отбеливателя во все продукты, связанные с кровью, при утилизации. Стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS) (1x) или фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) (без Ca2+ и Mg2+) могут использоваться взаимозаменяемо.
- Приготовьте буфер для разбавления: Дополните 1x стерильный PBS 2% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 0,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
- Приготовьте питательную среду: дополните среду RPMI-1640 FBS (10% (v/v)), глутамаксом (2 мМ) и пенициллином/стрептомицином (50 I.M./50 μg/мл)
- Предварительно охладите рабочий буфер (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя.
- Разбавьте цельную кровь двумя объемами разбавляющего буфера. С помощью серологической пипетки переведите 15 мл антикоагулянтной крови в пробирку объемом 50 мл, содержащую 30 мл буфера для разведения. Аккуратно перемешайте методом инверсии.
- На каждые 10 мл цельной крови или 30 мл разбавленной крови добавьте 15 мл градиентной среды плотности в пустую пробирку объемом 50 мл.
- Среду с градиентом плотности из шага 1.1.5 медленно и неуклонно вносите в 30 мл разбавленной крови с помощью серологической пипетки объемом 25 мл. Держите кончик пипетки у стенки трубки, а трубку под наклоном.
- Осторожно переложите пробирки в центрифугу с качающимся ведром. Не нарушайте эти две фазы. Центрифугируйте пробирки при давлении 400 x g при комнатной температуре (RT) в течение 25 мин с минимальным значением ускорения и замедления.
- Аккуратно снимите верхний (прозрачный) слой плазмы с помощью пипетки объемом 10 мл и утилизируйте его в емкости с отбеливателем (10%).
- Соберите интерфазный (белый) слой мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs, рис. 1) с помощью пипетки объемом 10 мл и переложите в свежую пробирку объемом 50 мл. Соедините белый слой из разных пробирок одного и того же донора в пробирке объемом 50 мл до 30 мл.
- Доведите каждую пробирку до общего объема 50 мл с помощью буфера для разбавления из шага 1.1.1 и центрифугируйте при 300 x g и 4 °C в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл и утилизируйте его в контейнере с отбеливателем (10%).
- Повторно суспендируйте каждую клеточную гранулу в 1 мл предварительно охлажденного рабочего буфера из шага 1.1.3 с помощью микропипетки p1000. Соедините клеточные суспензии от одного и того же донора в новой пробирке объемом 15 мл. Доведите объем каждой пробирки до 15 мл с помощью предварительно охлажденного рабочего буфера и хорошо перемешайте путем инверсии.
- Возьмите аликвоту 20 мкл клеточной суспензии из шага 1.1.11 и приготовьте разведение в соотношении 1:100 с использованием 1x стерильного PBS. Определяют номер клеток с помощью гемоцитометра.
- Центрифугируйте клеточную суспензию на шаге 1.1.11 при 300 x g и 4 °C в течение 10 мин и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл. При необходимости используйте микропипетку p200 для полного удаления надосадочной жидкости.
- Ресуспендируйте выделенные PBMC в 80 мкл предварительно охлажденного рабочего буфера MACS для каждого 1 x 107 элемента, добавляя максимум до 800 мкл буфера.
- Добавьте 20 мкл античеловеческих CD14 микрогранул на каждые 1 x 107 клеток или до 100 мкл на образец крови (~100 мл неразбавленной крови). Хорошо перемешать методом инверсии и поместить на вращатель трубок на 20 минут при непрерывном перемешивании при 4 °C.
- Извлеките образцы из вращателя пробирки, добавьте в каждую пробирку 10 мл предварительно охлажденного рабочего буфера и центрифугируйте при 300 x g (ускорение = 5, замедление = 5) и 4 °C в течение 10 минут.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл и ресуспендируйте до 1 x 108 клеток в 500 мкл предварительно охлажденного рабочего буфера (2 x 108/мл).
- Проводите выделение CD14-положительных клеток путем магнитной сортировки клеток с помощью ручной или автоматизированной системы (Table of Materials) в соответствии с инструкциями производителя.
- Возьмите аликвоту 20 мкл клеточной суспензии с этапа 1.1.18 после CD14-положительного отбора и приготовьте разведение 1:100 с использованием 1x стерильного PBS. Определите номер клеток путем подсчета клеток на гемоцитометре.
- Центрифугируйте CD14-положительные клетки при 300 x g и RT в течение 10 мин. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 10 мл или вакуумной системы.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу с этапа 1.1.20 в предварительно нагретой питательной среде с этапа 1.1.2 до конечной плотности клеток 1 x 107 клеток/мл.
- Засейте выделенные CD14-положительные моноциты с плотностью клеток 5 x 106 клеток.
- На чашку для культуры тканей диаметром 10 см добавьте 10 мл питательной среды из этапа 1.1.2 с добавлением 50 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF).
- Добавьте 0,5 мл клеточной суспензии с шага 1.1.21 в культуральную среду по каплям и аккуратно взболтайте планшет. Инкубируйте клетки в инкубаторе для культур увлажненных тканей (37 °C, 5%CO2) в течение ночи.
- На следующий день аспирируйте среду с помощью вакуумной системы, чтобы удалить клетки, которые не прикрепились за ночь. Добавьте 10 мл свежей питательной среды с добавлением GM-CSF (50 нг/мл) и инкубируйте клетки в инкубаторе для увлажненных культур тканей (37 °C, 5%CO2) в течение 7 дней для обеспечения полной дифференцировки (см. Рисунок 2A для появления моноцитов CD14+ на различных стадиях дифференцировки GM-CSF). Меняйте питательную среду каждые 2-3 дня и каждый раз добавляйте свежий GM-CSF (50 нг/мл).
2. Подготовка компонентов электропорации
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для неонового наконечника объемом 10 мкл (Таблица материалов). Для каждой трансфекции используйте 1-2 х10 5 клеток. Трансфицированные клетки рекомендуется засеивать на 48-луночный планшет или 8-луночную камерную чашку (10 мкл трансфицированных клеток на лунку). Вместо PBS можно использовать 1x стерильный DPBS (без Ca2+ и Mg2+).
- На 7-й день приготовьте среду без антибиотиков, добавив в среду RPMI-1640 FBS (10 % (v/v)) и глутамакс (2 мМ).
- Поместите бессывороточную среду RPMI-1640, раствор трипсина-ЭДТА (0,25%), 1x стерильный PBS (без Ca2+ и Mg2+) и полную питательную среду из шага 1.1.2 на водяную баню при температуре 37 °C.
- При использовании посуды со стеклянным дном (для конфокальной микроскопии) посуду покрыть поли-D-лизина гидробромидом.
- Покройте 8-луночную чашку 200 μл поли-D-лизина гидробромида (0,1 мг/мл в 1x стерильном PBS) и инкубируйте в течение 5 минут при РТ.
- Отсадите раствор поли-D-лизина и промойте стекло один раз стерильным PBS. Отдохните PBS и перейдите к шагу 2.4.
- Добавьте 200 мкл среды, не содержащей антибиотиков, в лунку 48-луночного планшета или чашки с 8 камерами и предварительно инкубируйте в инкубаторе для культур увлажненных тканей (37 °C, 5%CO2) до готовности к тарелированию трансфицированных клеток.
3. Подготовка ячеек к электропорации
ПРИМЕЧАНИЕ: Выход MDM из 10-сантиметровой чашки в конце 7-дневного периода дифференцировки составляет примерно 1,5 x 106 клеток. 1x стерильный DPBS (без Ca2+ и Mg2+) может быть использован вместо PBS. Этот протокол был оптимизирован таким образом, что большинство макрофагов отделяются от планшета с сохранением жизнеспособности и целостности клеток. МДМ трудно отделить от планшетов для клеточных культур. Поэтому может потребоваться выполнить шаги 3.2 и 3.3 дважды для диссоциации клеток. Следите за тем, чтобы время каждой инкубации с трипсином-ЭДТА (0,25%) не превышало 5 мин.
- Отсадите среду из полностью дифференцированных макрофагов на посуду диаметром 10 см и промойте монослой клеток теплой бессывороточной средой RPMI-1640. Обязательно полностью удалите среду.
- Соберите клетки, добавив 2 мл теплого раствора трипсина-ЭДТА (0,25%) на 10-сантиметровую чашку и инкубируйте в инкубаторе для культур увлажненных тканей (37 °C, 5%CO2) в течение 5 минут.
- Завершите отслойку клеток, аккуратно пипетируя раствор трипсина-ЭДТА (0,25%) вверх и вниз по всей площади чашки с помощью микропипетки p1000. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл теплой полной питательной среды, начиная с шага 1.1.2.
- Поднесите чашку к светлопольному микроскопу и проверьте наличие отслойки клеток в различных полях зрения. Если еще прикреплено значительное количество ячеек, повторите шаги 3.2-3.3.
- Центрифугируйте клеточную суспензию при 250 x g в течение 5 мин при RT.
- Аспирируйте среду и ресуспендируйте клетки в 10 мл 1x стерильного PBS, предварительно нагретого до 37 °C. Возьмите аликвоту 20 μL для определения количества клеток с помощью гемоцитометра.
- Возьмите 1-2 x 10-5 клеток на предполагаемую трансфекцию и поместите в пробирку объемом 15 мл. Доведите до конечного объема 15 мл с помощью предварительно подогретого 1x стерильного PBS. Центрифугируйте при 250 x g в течение 5 мин при RT.
- Отсадите PBS и центрифугируйте еще раз в течение 1 минуты при давлении 250 x g. Удалите остатки PBS из клеточной гранулы с помощью микропипетки p200.
4. Нуклеофекция компонентов каспазы BiFC в моноцитарные макрофаги человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола выполняется с использованием системы Neon Transfection System (Table of Materials). В этом протоколе описаны этапы трансфекции 1-2 x 105 клеток с использованием неонового наконечника объемом 10 мкл (Таблица материалов). Если вы используете неоновый наконечник объемом 100 μл, увеличьте масштаб соответственно. Избегайте воздействия на клетки ресуспендированного буфера R в течение более 15 минут, так как это может снизить жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции.
- Разведите репортерную плазмиду (т.е. mCherry или dsRedmito в концентрации 100 нг/мкл) в воде, не содержащей нуклеаз, или в 0,5-кратном TE-буфере для визуализации трансфицированных клеток.
- Разбавляйте плазмиды каспазы BiFC до соответствующей концентрации в воде, не содержащей нуклеаз, или в 0,5-кратном TE-буфере таким образом, чтобы общий объем плазмид не превышал 30% от общего объема трансфекции в 10 мкл (т.е. 300 нг/мкл C1 Pro-VC и 300 нг/л C1 Pro-VN).
- Приготовьте стерильную микропробирку объемом 1,5 мл на каждую предполагаемую трансфекцию и добавьте соответствующее количество репортерной плазмиды (т.е. 50 нг или 0,5 мкл) и каспазы BiFC (т.е. 300 нг или 1 мкл C1 Pro-VC и 300 нг или 1 мкл фрагмента C1 Pro-VN). Всегда держите микротрубки в вытяжке.
- Поместите станцию для дозатора, устройство, наконечники, электропорационные трубки и пипетку в стерильный колпак с ламинарным потоком.
заметка: Пипеткационная станция, устройство, наконечники, электропорационные трубки и пипетка входят в состав системы Neon Transfection.
- Подсоедините высоковольтный и сенсорный разъем на пипетной станции к задним портам устройства в соответствии с инструкциями производителя. Держите станцию дозатора рядом с устройством.
- Подключите шнур питания к задней розетке переменного тока и перейдите к подключению устройства к электрической розетке. Нажмите на выключатель питания, чтобы включить устройство.
- Введите параметры трансфекции на стартовом экране, который отображается при включении устройства и его надлежащем подключении. Нажмите на Voltage, введите 1000 и нажмите на Done, чтобы установить напряжение на 1000 В. Нажмите на Width, введите 40 и нажмите на Done, чтобы установить длительность импульса на 40 мс. Наконец, нажмите на # Импульсы, введите 2 и нажмите на Готово, чтобы установить количество электрических импульсов равным 2.
- Возьмите одну из электропорационных трубок (входит в комплект) и заполните ее 3 мл электролитического буфера E (для наконечников объемом 10 мкл и входят в комплект) в режиме RT. Вставьте электропорационную трубку в держатель пипетки на пипеточной станции. Убедитесь, что электрод на боковой стороне трубки направлен внутрь и что при вставке трубки слышен щелчок.
- Возьмите клеточную гранулу из шага 3.8 и добавьте 10 μL предварительно подогретого ресуспендированного R-буфера (входит в комплект) на каждые 1-2 x 105 клеток. Аккуратно перемешайте микропипеткой p20. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии в каждую пробирку, установленную на шаге 4.3, и аккуратно перемешайте микропипеткой p20.
- Возьмите пипетку и вставьте наконечник, нажав кнопку Push на втором упоре. Убедитесь, что зажим полностью захватывает монтажный шток поршня в наконечнике и что в верхней головке пипетки не наблюдается зазора.
- Чтобы аспирировать образец, нажмите кнопку «Кнопка» на пипетке до упора и опустите его в первую пробирку, содержащую смесь клеточной и плазмидной ДНК. Медленно отсасывайте смесь в наконечник пипетки.
заметка: Избегайте пузырьков воздуха, так как они могут вызвать дугу во время электропорации, а в случае обнаружения устройством могут помешать подаче электрического импульса. Если наблюдаются пузырьки воздуха, выпустите содержимое в трубку и повторите попытку аспирации.
- Очень осторожно вставьте пипетку с образцом в держатель пипетки. Убедитесь, что пипетка защелкивается и что она правильно размещена.
- Нажмите кнопку «Пуск» на сенсорном экране и подождите, пока не подадут электрические импульсы. Сообщение на экране будет указывать на завершение.
- Медленно снимите пипетку со станции и немедленно добавьте трансфицированную клеточную суспензию в соответствующую лунку с предварительно подогретой средой без антибиотиков из шага 2.4, медленно нажимая кнопку до первой точки.
заметка: Этот наконечник можно использовать до трех раз для одной и той же плазмиды; в противном случае выбросьте его в контейнер для биологически опасных отходов, нажав кнопку Push до второй остановки.
- Повторите шаги 4.10-4.14 для каждой пробирки, содержащей смесь клеточной/плазмидной ДНК.
- Осторожно покачайте планшет с трансфицированными клетками и инкубируйте в течение 1-3 ч в инкубаторе для увлажненных культур тканей (37 °C, 5%CO2).
- Добавьте в каждую лунку по 200 мкл предварительно подогретой питательной среды (полной среды) с шага 1.1.2. Снова поместите чашку в инкубатор для культур увлажненных тканей (37 °C, 5%CO2). Подождите не менее 24 часов для экспрессии генов.
- На следующий день проверяют жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
- Включите эпифлуоресцентный микроскоп и коробку с источником флуоресцентного света в соответствии с инструкциями производителя и поставьте чашку для культуры на предметный столик микроскопа.
- Выберите объектив 10x или 20x и фильтр 568 нм (RFP).
- Чтобы оценить жизнеспособность ячейки, нажмите кнопку «Светодиод проходящего света» (TL), чтобы визуализировать все ячейки в выбранном поле. Глядя в окуляр микроскопа, поворачивайте ручку фокусировки до тех пор, пока не будут замечены клетки, и проверьте наличие прикрепления клеток в выбранном поле.
заметка: Полностью прикрепленные клетки представляют собой жизнеспособные клетки, в то время как плавающие клетки представляют собой нежизнеспособные клетки. Если слияние лунки высокое, присутствие неприкрепленных клеток может быть результатом завышения количества клеток, а не результатом низкой жизнеспособности. Тем не менее, низкая конфлюентность, сопровождающаяся высоким содержанием плавающих клеток, указывает на низкую жизнеспособность, которая может быть результатом дугового разряда во время электропорации, токсичности плазмид или чрезмерного воздействия ресуспендированного R-буфера. Не используйте колодцы, которые демонстрируют последнее поведение.
- Чтобы оценить эффективность трансфекции, сосредоточьтесь на клетках в выбранном поле под действием проходящего света, как описано выше. Подсчитайте общее количество ячеек в выбранном поле. Когда светодиодный индикатор передаваемого света (TL) выключен, нажмите кнопку светодиода отраженного света (RL), чтобы включиться.
- Сосредоточьтесь на флуоресценции репортерного гена (эритроцитов) и подсчитайте общее количество красных флуоресцентных клеток. Повторите эти шаги (4.18.4-4.18.5) еще как минимум по два поля на лунку.
5. Лечение трансфицированных MDM и сбор данных о каспазе BiFC
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы планируете визуализировать клетки с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа, рекомендуется лечение qVD-OPH (20 μM) в течение 1 часа перед лечением выбранным стимулом для предотвращения каспазозависимой гибели клеток (преимущественно апоптоза). Это используется при визуализации, чтобы предотвратить отрыв клеток из-за апоптоза, что делает их очень трудными для визуализации, когда они выходят из фокальной плоскости. Следует отметить, что рекрутирование каспазы на платформу активации и связанная с ней каспазу BiFC не зависит от каталитической активности каспазы, и, следовательно, ингибирование каспазы не будет влиять на этот этап.
- Обрабатывайте выбранным стимулом примерно через 24 ч после трансфекции и инкубируйте столько, сколько необходимо для каждого препарата.
- Подготавливают среду для визуализации, дополняя питательную среду на этапе 1.1.2 Hepes (20 мМ, pH 7,2-7,5) и 2-меркаптоэтанол (55 μM).
- Добавьте желаемую концентрацию стимула в предварительно подогретый носитель изображения и аккуратно перемешайте.
- Осторожно удалите среду из ячеек с помощью микропипетки p1000 и добавьте 500 мкл раствора для стимулирования, начиная с шага 5.1.2, вниз по стенке лунки.
- Чтобы запустить необработанные контрольные лунки, добавьте среду визуализации без стимула.
- Инкубируйте клетки в инкубаторе с увлажненными культурами тканей (37 °C, 5%CO2) в течение срока, указанного для каждой обработки.
- Визуализируйте клетки с помощью эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа.
- Включите микроскоп и источник флуоресцентного света, следуя инструкциям производителя.
- Выберите объектив 10x или 20x и поместите чашку для культивирования на предметный столик микроскопа.
- С помощью окуляра микроскопа найдите клетки под фильтром 568 нм и сфокусируйтесь на клетках, экспрессирующих репортер dsRedmito/mCherry (эритроциты).
- Посчитайте все красные клетки в поле зрения и запишите их количество.
- Находясь в том же поле зрения, переключитесь на фильтры 488 или 512 (GFP или YFP), продолжайте подсчитывать количество красных клеток, которые также имеют зеленый цвет (Venus-положительный или BiFC-положительный), и записывайте это количество.
- Подсчитайте не менее 100 dsRedmito/mCherry -положительных клеток как минимум из трех отдельных полей зрения.
