Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка к эксперименту
- Изготовление устройства для культивирования органов кишечника (3 дня)
- С помощью 3D-принтера напечатайте многоразовые пластиковые формы для устройства для культивирования органов (устройство имеет 6 лунок, с 24 маленькими и большими отверстиями, а также для крышки устройства).
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пластиковые формы могут использоваться для изготовления многочисленных устройств.
- Вставьте иглы с тупым концом (22 G и 18 G) в соответствующее положение внутри формы устройства и отлите примерно 20 г смеси полидиметилсилоксана (PDMS) (соотношение веса 1:10, основание к катализатору) для одного комплекта устройства и крышки.
- Поместите формы в вакуумную камеру на 30 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха из смеси PDMS.
- Инкубируйте формы при температуре 55 °C в течение ночи, чтобы завершить полимеризацию PDMS.
- Когда PDMS будет установлена, вытащите иглы из формы и осторожно освободите устройство для культивирования и крышку от пластиковых форм.
- Удалите остатки PDMS с контура лунки с помощью хирургического лезвия. Прикрепите устройство PDMS и крышку устройства к защитному стеклу (микрослайды 75 мм x 50 мм) с помощью нетоксичного силиконового клея и оставьте детали на ночь (нанесите клей на гладкую сторону устройства).
- Вставьте двенадцать игл 22 G для просвета и двенадцать игл 18 G для лунки. Зафиксируйте все иглы на месте с помощью силикона и дайте застыть на ночь. Вставьте две иглы 18 G в крышку для обеспечения надлежащего потока воздуха внутрь и наружу устройства для культивирования органов кишечника.
- Проверьте все иглы на герметичность с помощью шприца, наполненного водой. Убедитесь, что из колодцев нет протечек, заполнив колодцы водой.
- Поместите по два хирургических узла на каждую иглу 22 G, которая будет соединена с толстой кишкой. Поместите устройство и крышку в автоклавный бумажный пакет и простерилизуйте в автоклаве.
- Питательная среда (0,5 ч)
- В биологическом колпаке смешайте следующее содержимое (в пробирке объемом 50 мл): 37 мл модифицированной среды Дульбекко от Iscove (IMDM), 10 мл заменителя сыворотки KSR, 1 мл добавки B27, 0,5 мл добавки N2, 0,5 мл 1 М буфера HEPES и 0,5 мл заменимых аминокислот.
- Отфильтруйте и храните всю среду при температуре 4 °C.
- Подготовка трубок и хирургических инструментов
- Отрежьте соответствующую длину трубок для входного просвета, входной ямы, выходного просвета и выходной лунки (12 коротких трубок и 12 длинных). Подсоедините соответствующий адаптер к каждой стороне трубки.
- Подготовьте хирургические инструменты: прямые ножницы, 4 тонких щипца и 2 острых щипца.
- Поместите трубки и хирургические инструменты в автоклавный бумажный пакет и простерилизуйте их с помощью автоклава.
- Подготовьте просветный ввод (желаемая стимуляция – бактерии, стул, лекарства и т.д.).
- Перед началом эксперимента определите бактериальную нагрузку бактериальной культуры путем серийного разведения и культивирования в аэробных и/или анаэробных условиях.
- После расчета бактериальной нагрузки разведите бактериальные культуры в стерильной питательной среде для тканей для получения необходимой концентрации бактерий. Образцы кала отфильтровать с помощью ситечка 100 мкм.
заметка: Для небактериальной стимуляции (лекарственными препаратами, метаболитами и т.д.) разбавляют вещество до необходимой концентрации с помощью питательной среды для кишечника.
2. Подготовка к эксперименту
- Внутри инкубатора для культивирования органов включите нагревательный блок, и установите его на 37 °C.
- Настройте насосы, а также входные и выходные шприцы.
- Ввод среды для культивирования тканей
- В биологическом или ламинарном проточном колпаке заполните входную лунку шприцев полной питательной средой. Конечный объем зависит от продолжительности эксперимента и скорости потока; обычно 1 мл/ч плюс дополнительная среда для продувки.
- Подсоедините трубки к шприцам с помощью адаптера Luer-lock. Поместите наполненные шприцы в шприцевые насосы.
- Продуйте входные шприцы. Следите за тем, чтобы среда лунки вытекала из всех трубок в отработанный стакан.
- Люминальный вход
- Наполните шприцы с люминальным вводом стимулирующей обработкой (бактериями, лекарственными препаратами и т.д.). Объем зависит от продолжительности эксперимента и скорости потока (обычно 30 мкл/ч плюс дополнительная среда для продувки).
- Подсоедините трубки к шприцам с помощью адаптера Luer-lock. Поместите наполненные шприцы в шприцевые насосы.
- Продуйте входные шприцы. Следите за тем, чтобы стимуляция вытекала из всех трубок в отработанный стакан. Будьте осторожны, чтобы не загрязнить различные стимулы.
- Выходы
- Поместите пустые шприцы в выходные шприцевые насосы (установите режим помпы в положение «Вывод»).
- Настройка устройства
- Установите регулятор, регулирующий расход газовой смеси (95% O2 + 5% CO2) для равномерного минимального расхода.
- Осмотрите прибор в ламинарном капюшоне.
- Промойте иглы прибора стерильным IMDM для промывания игл.
- Добавьте по 500 мкл стерильной питательной среды в каждую лунку устройства.
- Подготовка к рассечению тканей
- Поместите стерильные хирургические инструменты внутрь ламинарного капюшона.
- Наполните шприц объемом 10 мл стерильным IMDM и подключите стерильную (автоклавированную) иглу с тупым концом 22 G для промывания толстой кишки.
3. Органные культуры
- Жертвоприношение мышей и вскрытие тканей
- В ламинарном капюшоне принесите в жертву мышей в возрасте от 12 до 14 дней путем обезглавливания. Опрыскайте мышей 70% этанолом и поместите мышей на пластиковую тарелку.
- С помощью острых ножниц и щипцов препарируйте мышь и выньте пищеварительный тракт от желудка к анальному отверстию, разрезав весь жир и соединительные ткани. Разрежьте двоеточие и положите его на новую тарелку.
заметка: Свести к минимуму контакт с тканями толстой кишки. Не прикасайтесь к средней части тканей толстой кишки. Держите салфетку аккуратно и только по краям ткани.
- Промывка и промывка толстой кишки
- Под диссекционным микроскопом подготовленным шприцем объемом 10 мл аккуратно промыть содержимое толстой кишки стерильным ИМДМ (в проксимальную сторону) (шаг 2.7.2). После удаления кала из кишечной ткани поместите толстую кишку в новую 6-луночную пластину, заполненную 0,5 мл стерильного IMDM.
- Подключение двоеточия к устройству
- Возьмите ткань, аккуратно соедините ее с иглой 22 G и сделайте тугую завязку двумя нитками. На этом этапе крайне важно поддерживать правильную ориентацию толстой кишки по отношению к потоку просвета (проксимальная = вход, дистальная = выход). Повторите шаги 3.2-3.3 для всех 6 салфеток.
- Убедитесь, что входные фиксаторы Люэра иглы пусты от среды. Если нет, опорожните их. Добавьте стимуляции во входную иглу замка Люэра (чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в просвет). Повторите этот шаг для каждой толстой кишки с соответствующей стимуляцией.
- Убедитесь, что все салфетки подключены, и наденьте крышку на верхнюю часть устройства.
- Подключение устройства для культивирования органов к насосам
- Поместите устройство в предварительно нагретую камеру с регулируемой температурой (37 °C).
- Подключение потока газа
- Подсоедините газовый адаптер к крышке крышки с помощью соответствующей входной иглы.
- Подключите входную и выходную трубки к устройству.
заметка: Подсоедините проксимальную сторону ободочной кишки к входным ванночкам.
- Продуйте просвет с помощью входов стимуляции.
- Осторожно проводите световую стимуляцию через кишечник и проверяйте поток среды в выходных трубках.
- Промойте внешнюю среду.
- Промойте внешнюю среду 3 раза (установите насосы со скоростью 600 мкл/мин как для входной, так и для выходной лунки). Каждая промывка занимает 1 минуту (начиная с опорожнения колодца).
- Начните эксперимент.
- Запустите насосы со следующими скоростями:<бр/>
Расход: люмен: вход - 30 мкл/ч, выход - 35 мкл/ч<бр/>
Внешняя среда: вход - 1000 μл/ч, выход - 950 μл/ч<бр/>
заметка: Время эксперимента может варьироваться от 30 минут до 24 часов.
- Окончание эксперимента (до 24 ч для посева органов толстой кишки)
- Отсоедините все трубки от прибора.
- Отсоедините салфетки от игл и продолжайте до нужных показаний.
