Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Подготовка к WS-CM
- Генерируйте цельную дымовую кондиционированную среду (WS-CM), как описано выше.
- Приготовьте WS-CM, пропустив дым от четырех эталонных сигарет 3R4F через среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 без фенолового красителя, используя следующий режим курения: 35-60-2, объем затяжки в мл, интервал затяжки в секундах и продолжительность затяжки в секундах соответственно. Для каждого препарата образуется образец объемом 20 мл.
- Пробирка (трубки) с указанием даты, времени завершения, а также названия и номера сигареты. Храните аликвоты объемом 500 мкл при температуре -80 °C сразу после завершения курения.
- Проанализируйте аликвоты замороженных WS-CM для определения уровней никотина, специфических для табака нитрозаминов и полициклических ароматических углеводородов, как описано ранее.
2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови, PBMCs
- Соберите свежую кровь у здоровых доноров (которые не являются потребителями табачных изделий) Изолируйте PBMC из свежей крови, как описано ниже.
- До прибытия пакета с кровью подготовьте флакон объемом 500 мл, ножницы, изоляционный буфер и фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) (RT) в колпаке для клеточных культур уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Изоляционный буфер должен быть защищен от света.
- Держите пакет с кровью вверх дном и разрежьте трубку чуть ниже того места, где он был зажат, оставив трубку не менее 3 см.
- Снимите крышку с флакона объемом 500 мл и держите тюбик над отверстием флакона. Возьмите мешок с кровью и переверните его, чтобы кровь свободно текла из пакета в бутылку до тех пор, пока пакет не опустеет. Позвольте крови стекать на внутреннюю стенку бутылки, а не прямо вниз, чтобы избежать образования пузырьков.
- Налейте в бутылку изоляционный буфер в соотношении 1:5 к крови. Плотно закройте бутылку крышкой и аккуратно переверните ее из конца в конец 10 раз. Оставьте флакон в колпаке для клеточных культур для инкубации с выключенным светом на 1 час при RT.
- Над кровью будет формироваться светлый слой соломенного цвета. Удалите этот слой с помощью серологической пипетки объемом 25 мл в конические пробирки по 50 мл. Собранное количество может варьироваться в пределах 50 – 300 мл, в зависимости от субъекта, который сдавал кровь.
- Центрифугируйте пробирки при давлении 200 x g в течение 10 минут при RT.
- Отсадите полупрозрачную надосадочную жидкость, оставив гранулу темного цвета крови. Гранулы будут рыхлыми, но вязкими.
- Пипетка 3 мл изоляционного буфера в конические пробирки по 15 мл.
- К ресуспензионной грануле добавьте 20 мл DPBS на каждые 50 мл жидкости соломенного цвета, собранной на шаге 2.1.5. Вихрь тщательно перемешать, а ресуспендированную жидкость закрепить из нескольких пробирок. Эта жидкость содержит взвешенные клетки крови.
- С помощью передаточной пипетки перенесите 5 мл взвешенных клеток крови на 3 мл изоляционного буфера на шаге 2.1.8. Медленно и осторожно наклоните коническую трубку объемом 15 мл, содержащую клеточную суспензию, чтобы создать два отдельных слоя. Центрифугируйте пробирки при давлении 400 x g в течение 40 мин при RT с минимальным ускорением и без тормоза.
- С помощью передаточной пипетки удалите образовавшийся мутный средний слой (охристый слой), содержащий PBMC, в коническую пробирку объемом 50 мл. Не рисуйте другие прозрачные слои под ним. Переливайте не более 25 мл в каждую коническую пробирку объемом 50 мл.
- Добавьте 25 мл буфера холодного хода (или больше, чтобы заполнить весь оставшийся объем конической трубки объемом 50 мл) для промывки ячеек. Центрифугируйте клетки при 400 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Повторно суспендируйте гранулу с 10 мл проточного буфера. Он содержит PBMC. Подсчитайте ячейки и используйте их немедленно или положите на лед для заморозки.
3. Замораживание и размораживание PBMC
- Центрифугируют мононуклеарные клетки крови (ПМЦ) эрифера, собранные на шаге 2.1.13, в течение 10 мин при 400 х г.
- Наполните контейнер для заморозки изопропиловым спиртом в соответствии с инструкциями производителя.
осторожность: Изопропиловый спирт легковоспламеняющийся и остротоксичный.
- Ресуспендируйте гранулу средой RPMI 1640 (4 °C), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (DMSO). Это среда для замораживания RPMI 1640. Повторно суспендируйте гранулу таким количеством замораживающей среды, которое приведет к получению суспензии с концентрацией около 5 x 107 клеток/мл. Количество ячеек, доступных для заморозки, будет варьироваться.
- Раздайте 1 мл аликвоты клеточной суспензии в криопробирки объемом 2 мл и поместите криопробирки в контейнер для заморозки. Поместите контейнер для заморозки с криопробирками в морозильную камеру при температуре -80 °C для хранения O/N, а затем извлеките криопробирки и перенесите на хранение в криогенную морозильную камеру при температуре от -150 °C до -190 °C.
- Извлеките криопробирку из криогенного хранилища и быстро разморозьте ее при осторожном перемешивании на водяной бане при температуре 37 °C.
- Немедленно переложите размороженные PBMC в криопробирке в коническую пробирку объемом 15 мл с полной средой RPMI 1640 объемом 10 мл (4 °C), содержащей 10% FBS, 1% Pen/Strepping и 1% L-глутамина. Содержимое размороженной криопробирки должно быть перенесено как можно скорее для получения максимальной жизнеспособности клеток.
- Центрифугируйте PBMC при давлении 400 x g в течение 10 минут.
- Повторно суспендируйте гранулу с 5 мл RPMI 1640 в полной среде и подсчитайте ячейки.
- Измеряйте жизнеспособность клеток с помощью установленных методов, таких как метод исключения трипанового синего. Как правило, жизнеспособность клеток при использовании этого метода составляет около 90 - 95%. В настоящее время ПМК готовы к использованию в экспериментах.
4. Внутриклеточное окрашивание и проточная цитометрия
ПРИМЕЧАНИЕ: Перечисленные здесь разведения предназначены для целей этого исследования. Разведение можно регулировать соответствующим образом.
- Разбавляют WS-CM в 96-луночном планшете с использованием полной среды RPMI до общего объема 100 мкл/лунку в концентрации 0,3, 1,56, 3 и 5 мкг/мл эквиникотиновых единиц.
- В той же тарелке разведите никотин до следующих концентраций: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 и 4000 мкг/мл.<бр/>
осторожность: Никотин крайне токсичен и опасен для окружающей среды.
- Добавьте 100 мкл PBMCs, взвешенных в полной среде RPMI в концентрации 1 × 106 клеток/лунку. Общий объем клеток плюс WS-CM или никотин составит 200 μл/лунку.
- Накройте тарелку крышкой и выдерживайте в течение 3 часов при 37 °C и 5%CO2.
- Промойте клетки в режиме RT центрифугированием при 300 × г в течение 3 минут, отсасывая надосадочную жидкость, делая вихревую обработку нижней части планшета с закрытой пластиной и, наконец, ресуспензируя ячейки 200 μл ледяного буфера, и повторите этап промывки еще раз.
- Добавьте в тарелку 200 μл полной среды RPMI и повторите этап промывки еще раз.
- Приготовьте рабочие концентрации 2 мкл/мл GolgiPlug и 10 мкг/мл ЛПС с использованием полной среды RPMI и добавьте по 200 мкл в каждую лунку.
- Инкубируйте планшет в течение 6 часов при 37 °C и 5%CO2.
- В конце шага 9.8 промойте ячейки с проточным буфером (4 °C) и отжмите при 300 x g в течение 3 минут при 4 °C.
- Добавьте по 100 мкл Cytofix в каждую лунку и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C.
- Промойте ячейки 3 раза, как описано в шаге 9.9, 1x Permwash (4 °C) при 300 x g в течение 3 минут при 4 °C.
- Добавьте 45 мкл 1x Cytoperm в каждую лунку, а затем по 5 мкл каждого из следующих антител в каждую лунку: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 30 минут.
- Промойте ячейки два раза, как описано в шаге 9.9, 1x Permwash (4 °C) и один раз с рабочим буфером (4 °C) при 300 x g в течение 3 минут при 4 °C.
- Ресуспендируйте клетки 200 мкл 2% параформальдегида (4 °C). Перенесите клетки в пробирки диаметром 12 × 75 мм и проанализируйте образцы на проточном цитометре.
осторожность: Параформальдегид вызывает коррозию, остро токсичен и представляет опасность для здоровья.
