Синтез биопленки in vitro золотистым стафилококком

1. Получение биопленки in vitro

1. Получите изолированные колонии S. aureus из криоконсервированного сырья с помощью метода полосовой пластины на богатой питательными веществами агаровой пластине, такой как триптический соевый агар (см. Таблицу материалов).
2. Покройте отдельные лунки 96-луночного планшета 100 мкл 0,001% (v/v) поли-L-лизина (ФАПЧ), разведенного в стерильном H2O, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин. Асептически отаскайте раствор ФАПЧ с помощью вакуумной аспирационной ловушки. Дайте лункам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.
   заметка: Если не указано иное, все этапы аспирации в протоколе выполняются с использованием вакуумной аспирационной ловушки.
3. Приготовьте ночную культуру путем инокуляции колонии S. aureus в минимальную эссенциальную среду альфа (MEMα) с добавлением 2% глюкозы и инкубируйте при 37 °C, встряхивая при 200 об/мин в течение 16-18 часов.
4. Разбавляют культуру в течение ночи путем переноса 50 мкл на 5 мл свежего MEMα с добавлением 2% глюкозы и инкубируют при 37 °C, встряхивая при 200 об/мин, до среднелогарифмической фазы, как правило, между оптической плотностью 600 (OD_{600 нм)} 0,5-0,8. Используйте MEMα для нормализации среднелогарифмической культуры до наружного диаметра_{600 нм,} равного 0,1.
5. Перенесите 150 мкл нормализованной культуры в каждую лунку 96-луночного планшета, обработанного ФАПЧ. Статическая инкубация в течение 18-20 ч в увлажненной камере при температуре 37 °C.<бр/> заметка: Биопленки также могут быть выращены в других форматах, таких как μ-канальные слайды (см. Таблицу материалов).
6. Аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить планктонные клетки. Аккуратно промойте оставшуюся биомассу 150 μл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS), чтобы удалить неприкрепленные клетки. Добавляйте HBSS по каплям, чтобы не нарушить биопленку.
   заметка: При аспирации надосадочной жидкости и HBSS во время промывки оставляйте в лунках, содержащих биопленку, достаточно жидкости (надосадочной жидкости или HBSS), чтобы биопленка все еще оставалась погруженной. Это предотвращает разрушение структуры биопленки при добавлении HBSS по каплям для промывки биопленки.
7. Повторите шаг 1.6 еще не менее двух раз, чтобы удалить все планктонные клетки. На данный момент биопленки готовы к немедленным последующим экспериментам.
   заметка: Если биопленки не используются для экспериментов с нейтрофилами, HBSS можно заменить фосфатно-соевым буфером (PBS). HBSS предпочтительнее PBS, поскольку HBSS содержит компоненты, включая глюкозу, которые обеспечивают оптимальные условия для активации нейтрофилов.