1. Антигенный препарат
ПРИМЕЧАНИЕ: Три различных антигенных препарата могут быть использованы для оценки иммунного ответа на Hi. К ним относятся: 1) субклеточный компонент (обычно из клеточной стенки бактерии); 2) убитые и инактивированные бактерии; и 3) живые бактерии. Определите применение каждого антигенного препарата до начала любых экспериментов.
- Субклеточные компоненты
- Получение субклеточных компонентов из источников, включая коммерческие препараты, компоненты собственной разработки и/или от других исследователей.
заметка: Могут быть использованы субклеточные компоненты, обычно из клеточной стенки бактерий, которые включают в себя белки внешней мембраны, такие как P6 и липулигосахарид (LOS). Эти субклеточные компоненты обычно выводятся в специализированных центрах. Описание того, как они делаются, выходит за рамки данной статьи. Для получения этих компонентов рекомендуется прямой контакт со специалистами в этой области.
- Убитые/инактивированные бактерии
- Получите бактерии из соответствующего образца (например, из мокроты или бронхоскопии). Подтвердите штамм как H. influenzae с помощью соответствующей микробиологической лаборатории. Выполните типирование образцов H. influenzae, чтобы подтвердить, что они не поддаются типированию (NTHi, специализированной микробиологической лабораторией).
- Чтобы получить репрезентативный антиген, используйте несколько штаммов NTHi (не менее 5, каждый примерно одинакового количества) для создания объединенного антигена. Храните штаммы при температуре -70 °C в глицериновом бульоне в микроцентрифужных пробирках.
заметка: В этом эксперименте было использовано десять различных штаммов.
- Разморозьте штаммы (по одной микроцентрифужной пробирке за раз) на шоколадных агаровых пластинах и выращивайте в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2. Добавьте бактерии в 500 μL фосфатно-солевого буфера (PBS) и промойте их дважды (отжим при 300 x г в течение 5 минут). Используйте стандарт МакФарланда или спектрофотометр для аликвоты NTHi до концентрации 10-8 мл (используя контейнер объемом 5 мл или эквивалент).
- Нагрейте бактерии, обезвредив их, поместив на водяную баню при температуре 56 °C на 10 минут.
- Обрабатывайте бактерии ультразвуком с помощью непрерывной ультразвуковой обработки на низкой и средней скорости в течение 30 секунд.
- Распределите соответствующий объем образцов по микроцентрифужным пробиркам. Для образца объемом от 10до 8 мл используйте аликвоты объемом 50 мкл (т.е. 20 образцов на мл) и заморозьте их при температуре -70 °C до тех пор, пока не потребуется.
- Живые бактерии
- Во-первых, охарактеризуйте живые бактерии, как указано в шаге 1.2.1. Используйте один хорошо охарактеризованный сорт. Следите за тем, чтобы штамм также хранился в глицериновом бульоне при температуре -70 °C в качестве резерва.
- Выращивайте бактерии на обогащенных средах, таких как шоколадные агаровые тарелки или в бульоне.
- Чтобы использовать шоколадные агаровые пластины, разбрасывайте бактерии минимум каждые 3-4 дня с помощью стерильных разбрасывателей.
- В качестве альтернативы используйте бульон Brain Heart Infusion (BHI), обогащенный факторами X (гемин) и V (β-никотинамидадениндинуклеотид) для выращивания бактерий. Инокулировать NTHi из ночных планшетов в 5-10 мл бульона BHI с добавлением гемина и β-никотинамидадениндинуклеотида (оба 10 мкг/мл) и культивировать в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2><.
заметка: Преимущество этого заключается в воспроизводимости, более высоком количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) и в том, что все бактерии находятся на одной и той же стадии роста бревен (на планшетах жизнеспособность бактерий может быть выше в зависимости от положения в культуре).
- Используйте множественность инфекции (MOI) из 100 бактерий в одной клетке, чтобы вызвать сильный иммунный ответ при сохранении жизнеспособности клеток. Используйте стандарт МакФарланда или спектрофотометр для оценки количества бактерий.
- Убедитесь, что среда, используемая для анализа NTHi в прямом эфире, не содержит сыворотки человека, так как это убьет бактерии. Образцы сыворотки животного происхождения (например, сыворотка теленка плода) обычно не вызывают никаких проблем><.
заметка: Используйте описанные ниже методы для анализа стандартных образцов тканей, таких как периферическая кровь, образцы бронхоскопии (в частности, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ)) и резецированная легочная ткань. Инкубируйте образцы с антигеном Hi от 10 мин до 24 ч и более.
2. Оценка функции лимфоцитов в периферической крови
- Используйте цельную кровь или препараты мононуклеарных клеток для анализа проточной цитометрии.
- Возьмите образцы у каждого субъекта с помощью венепункции. Соберите 4 мл крови из периферической вены в пробирке с литиевым гепарином и разделите образцы на аликвоты для контроля и стимуляции антигена.
- Добавьте костимулирующие антитела (анти-CD28 и CD49d, 1 мкл/мл) к обоим образцам. Добавьте NTHi в образец антигена и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2 в течение 1 ч. Для убитого препарата NTHi добавляют 200 мкл антигена на 2 мл крови. Для живых NTHi добавьте живые NTHi клетки с MOI 100:1 к лейкоцитам (измеренным гемоцитометром).
- Добавьте к образцам блокатор Гольджи Брефельдин А (10 мкл/мл) и инкубируйте их еще 5 г.<бр/>
заметка: Блокирование аппарата Гольджи предотвращает вывоз цитокинов за пределы клетки.
- Если используется цельная кровь, лизируйте эритроциты 0,8% хлорида аммония, чтобы в растворе остались только лейкоциты. Фиксируют лейкоциты с помощью 500 мкл 1%-2% параформальдегида в течение 1 ч.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, проникните в 10 6 клеток 100 мкл 0,1% сапонина в течение 15 мин и инкубируйте клетки с флуоресцентными антителами. Промойте клетки и проанализируйте их с помощью проточного цитометра.
заметка: Количество меченых флуоресцентных антител будет специфичным для каждого цитокина. Следуйте инструкциям производителя. Как правило, 106 клеток в 100 мкл раствора окрашивают в течение 1 ч. Большинства коммерчески полученных антител будет достаточно для проведения 25-100 тестов.
- Определите долю антиген-реагирующих клеток путем гейтирования соответствующей популяции лимфоцитов (клетки определяются CD45, затем CD3, а затем экспрессией CD4 или CD8), как показано на рисунке 1. Проводите фоновое окрашивание нестимулированных клеток для всех анализируемых цитокинов. Проведите скрининг 100 000 клеток для анализа каждого цитокина как на стимулированные клетки, так и на контроль.
