$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
1. Антигенный препарат
- Живые бактерии
- Во-первых, охарактеризуйте живые бактерии. Получите бактерии из соответствующего образца (например, из мокроты или бронхоскопии). Подтвердите штамм как Haemophilus influenzae с помощью соответствующей микробиологической лаборатории. Выполните типирование образцов H. influenzae, чтобы подтвердить, что они не поддаются типированию (специализированной микробиологической лабораторией). Используйте один хорошо охарактеризованный сорт. Следите за тем, чтобы штамм также хранился в глицериновом бульоне при температуре -70 °C в качестве резерва.
- Выращивайте бактерии на обогащенных средах, таких как шоколадные агаровые тарелки или в бульоне.
- Чтобы использовать шоколадные агаровые пластины, разбрасывайте бактерии минимум каждые 3-4 дня с помощью стерильных разбрасывателей.
- В качестве альтернативы используйте бульон Brain Heart Infusion (BHI), обогащенный факторами X (гемин) и V (β-никотинамидадениндинуклеотид) для выращивания бактерий. Инокулировать нетипируемую H. influenzae (NTHi) из ночных планшетов в 5-10 мл бульона BHI с добавлением гемина и β-никотинамидадениндинуклеотида (оба 10 г/мл) и культивировать в течение ночи при 37 °C в 5% инкубаторе с углекислым газом и CO2.
заметка: Преимущество этого заключается в воспроизводимости, более высоком количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) и в том, что все бактерии находятся на одной и той же стадии роста бревен (на планшетах жизнеспособность бактерий может быть выше в зависимости от положения в культуре).
- Используйте множественность инфекции (MOI) из 100 бактерий в одной клетке, чтобы вызвать сильный иммунный ответ при сохранении жизнеспособности клеток. Используйте стандарт МакФарланда или спектрофотометр для оценки количества бактерий.
- Убедитесь, что среда, используемая для анализа NTHi в прямом эфире, не содержит сыворотки человека, так как это убьет бактерии. Образцы сыворотки животных (например, сыворотка плода теленка), как правило, не вызывают никаких проблем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте описанные ниже методы для анализа стандартных образцов тканей, таких как периферическая кровь, образцы бронхоскопии (в частности, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ)) и резецированная легочная ткань. Инкубируйте образцы с антигеном Hi от 10 мин до 24 ч и более.
2. Оценка функции лимфоцитов/медиаторов воспаления в легочной ткани
- Обычно не удается получить достаточное количество лимфоцитов с помощью бронхоскопии, поэтому используйте легочную ткань из образцов лобэктомии. Оптимизация образцов легочной ткани требует тесного взаимодействия со службой патологоанатомической патологии. Убедитесь, что ткань находится на расстоянии не менее 3 см от опухоли и является клеточной тканью без значительной эмфиземы (по определению патологоанатома).
- Разбейте легочную ткань на клеточную суспензию, прежде чем ее можно будет использовать для анализов проточной цитометрии. Переварите легочную ткань химическим путем (например, с помощью коллагеназы) или разукрупните ее механически.
заметка: Механическая дезагрегация ткани может быть предпочтительной, поскольку она связана с лучшим окрашиванием поверхности клеток (например, мечение CD3/4).
- Получите образцы лобэктомии у патологоанатома (обычно полученные от пациентов, проходящих лечение рака легких). Нарежьте около 20-40 г образца на3 среза по 3-5 мм. Поместите их в стерильную камеру объемом 50 мкл перед механическим фрагментированием с помощью соответствующего дезагрегатора.
- После дезагрегации тканей лизируют эритроциты 0,8% хлорида аммон><ия в соотношении 10:1 (т.е. 5 мл).
заметка: В качестве альтернативы можно использовать автоматизированную систему, такую как Q-prep.
- Ресуспендируйте клетки в стерильной RPMI (объем будет зависеть от количества клеток и обычно составляет 10-20 мл), а затем отфильтруйте их через стерильную нейлоновую сетку толщиной 100 мкм. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью метода исключения трипанового синего.
3. Анализ на инфекцию NTHi
- Ресуспендировать клетки легких до конечной концентрации клеток 4 x 106 клеток/мл на пробирку (контрольные и стимулированные образцы).
- Используйте суспензию 4 x 106-6 x10 6 клеток в 1 мл RPMI для (отрицательной) контрольной трубки. Используйте такое же количество для пробирки NTHi (любой дополнительный образец может быть использован в качестве положительного контроля со стафилококковым суперантигеном Е (SEB). Инфицируйте клетки в трубке NTHi с MOI 100 бактерий на клетку. Ослабьте крышку на полоборота, чтобы обеспечить передачу газа в трубках.
- Поместите клетки в вращатель трубок и инкубируйте их при температуре 37 °C при вращении со скоростью 12 об/мин.
- Для предотвращения внеклеточного экспорта цитокинов в клеточные суспензии через 1 ч после стимуляции добавляют блокатор Гольджи (Брефельдин А) до конечной концентрации 10 мкг/мл. Верните суспензии клеток для дальнейшей инкубации в течение 16-22 часов при вращении.
- Промыть клеточную суспензию 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,01% азида натрия, NaN3.
- Добавить антитела для внутриклеточного окрашивания цитокинов (выбор антител определяет исследователь). Окрашивать клеточную суспензию на специфические маркеры клеточной поверхности лимфоцитов человека (например, CD45, CD3 и т.д.) в течение 1 ч. Промойте клетки PBS, закрепите и пропитайте их.
- Зафиксируйте клетки с помощью 500 мкл 1%-2% параформальдегида в течение 1 ч.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, проникните в 10 6 клеток 100 мкл 0,1% сапонина в течение 15 мин и инкубируйте клетки с флуоресцентными антителами. Промойте клетки и проанализируйте их с помощью проточного цитометра.
заметка: Количество меченых флуоресцентных антител будет специфичным для каждого цитокина. Следуйте инструкциям производителя. Как правило, 106 клеток в 100 мкл раствора окрашивают в течение 1 ч. Большинства коммерчески полученных антител будет достаточно для проведения 25-100 тестов.
- Инкубируйте клетки с антителами, окрашивающими внутриклеточные цитокины (например, интерфероном-гамма, ИФН-γ и фактором некроза опухоли бета, TNF-α или интерлейкином, IL-13 и IL-17A) в течение 1 ч
заметка: Рекомендуется сначала окрашивать поверхностные маркеры, а затем внутриклеточные, так как фиксация может вызвать конформационные изменения в поверхностных белках, с которыми связываются антитела.
- Промойте клетки 500 мкл PBS и повторно суспендируйте в 100 мкл PBS перед получением данных на проточном цитометре.