Определение продукции нейтрофилов АФК при взаимодействии с опсонизированной биопленкой

Аннотация

Источник: Rana, P. S. J. B., et al. Стандартизированные анализы in vitro для визуализации и количественной оценки взаимодействий между нейтрофилами человека и биопленками золотистого стафилококка. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео мы демонстрируем анализ хемилюминесценции in vitro для обнаружения генерации активных форм кислорода нейтрофилами при воздействии опсонизированной бактериальной биопленки.

Протокол

1. Измерение АФК, производимых нейтрофилами

1. Добавьте 100 мкл 20% нормальной человеческой сыворотки (разведенной в HBSS) по каплям в промытую биопленку и инкубируйте при 37 °C в статических условиях в течение 30 минут для опсонизации биопленки.
2. Отсадите 20% раствор сыворотки и промойте биопленки по каплям 150 мкл HBSS один раз. Аспирируйте HBSS, оставляя после себя лунки с опсонизированными биопленками.
   заметка: Для интерпретации эксперимента рекомендуется использовать как минимум четыре группы: (А) нейтрофилы + биопленка, (В) нейтрофилы + ФМА (положительный контроль, см. таблицу материалов), (В) только нейтрофилы и (D) только биопленка.
3. Добавьте люминол (см. Таблицу материалов) к нейтрофилам, ресуспендированным в HBSS в концентрации 4 x 10⁶ клеток/мл таким образом, чтобы конечная концентрация люминола составила 50 мкМ. Это решение готово к использованию для групп (A) и (C). Добавьте 4 х 10⁵ нейтрофилов, смешанных с люминолом, в лунки с опсонизированными биопленками.
4. В отдельной пробирке приготовьте 50 мкМ раствор люминола в HBSS без нейтрофилов и добавьте его в лунку, содержащую биопленку (группа D).
5. Аликвоту 350 мкл нейтрофилов смешать с люминолом и добавить в смесь форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) в конечной концентрации 500 нг/мл. Для группы (В) добавить 4 х^{10 5} нейтрофилов из этой смеси в лунки без биопленки. Это служит положительным контролем.
   заметка: Концентрация PMA, указанная на этом этапе, относительно высока, чтобы обеспечить устойчивую реакцию на всплеск, поскольку PMA-стимулированные нейтрофилы являются положительным контролем. PMA можно использовать в более низкой концентрации для активации нейтрофилов, в зависимости от эксперимента.
6. Центрифугируйте планшет при температуре 270 x g в течение 30 с при 4 °C.
7. Убедитесь, что считыватель пластин настроен на 37 °C вместе с настройкой люминесценции и кинетического считывания в течение 60 минут с интервалом в 3 минуты. Поместите планшет в считыватель планшетов для измерения продукции нейтрофилов АФК в течение 60 мин.<бр/> заметка: Для этого анализа биопленки выращивали в белых планшетах, используемых для люминесцентных анализов. ПМА является известным агонистом ответа на окислительный взрыв. При проведении исследований с использованием ФМА убедитесь, что ФМА добавляется на заключительном этапе, пока раствор, содержащий нейтрофилы, холодный, поскольку ФМА немедленно инициирует реакцию всплеска.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Конические центрифужные пробирки объемом 50 мл	Термо Сайентиал	339652
Спиртовой тампон	БД		Используется для забора крови
Счетчик ячеек	Поставка Bal	202С
Плиты из полистирола с прозрачным дном 96 лунок с плоским дном	Костар	No 3370
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) 1x	Gibco	14190-144
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-СВ	Без кальция, магния и фенола красный
Гемоцитометр	Яркая линия
Люминол	сигма	А8511-5Г
Минимальные необходимые носители (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
Нормальная человеческая сыворотка	Технология дополнения	Национальная служба здравоохранения (NHS)
Чашка Петри (100 x 15 мм)	ВВР	25384-342 (Английский)
Форбол 12-миристат 13-ацетат
Раствор поли-L-лизина	сигма	П4707-50МЛ
Программное обеспечение SoftMax Pro	Молекулярные приборы		Программное обеспечение для считывателя микропланшетов, используемое для сбора данных
SpectraMax i3x	Молекулярные приборы		Считыватель микропланшетов

гг.