Анализ in vitro для изучения взаимодействия нейтрофилов и биопленки

Аннотация

Источник: Rana, P. S. J. B., et al. Стандартизированные анализы in vitro для визуализации и количественной оценки взаимодействий между нейтрофилами человека и биопленками золотистого стафилококка. J. Vis. Exp. (2022)

Это видео демонстрирует анализ in vitro для изучения взаимодействия нейтрофилов и биопленки. Патогенные бактерии, встроенные в биопленку, и выделенные нейтрофилы были помечены с помощью флуоресцентных меток, а иммунный ответ нейтрофилов и уклонение бактерий от иммунного ответа оценивались с помощью флуоресцентного микроскопа.

Протокол

1. Получение биопленки in vitro

1. Получите изолированные колонии S. aureus из криоконсервированного сырья с помощью метода полосовой пластины на богатой питательными веществами агаровой пластине, такой как триптический соевый агар (см. Таблицу материалов).
2. Покройте отдельные лунки 96-луночного планшета 100 мкл 0,001% (v/v) поли-L-лизина (ФАПЧ), разведенного в стерильном H2O, и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин. Асептически отаскайте раствор ФАПЧ с помощью вакуумной аспирационной ловушки. Дайте лункам высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.
   заметка: Если не указано иное, все этапы аспирации в протоколе выполняются с использованием вакуумной аспирационной ловушки.
3. Приготовьте ночную культуру путем инокуляции колонии S. aureus в минимальную эссенциальную среду альфа (MEMα) с добавлением 2% глюкозы и инкубируйте при 37 °C, встряхивая при 200 об/мин в течение 16-18 часов.
4. Разбавляют культуру в течение ночи путем переноса 50 мкл на 5 мл свежего MEMα с добавлением 2% глюкозы и инкубируют при 37 °С, встряхивая при 200 об/мин, до среднелогарифмической фазы, обычно между оптической плотностью 600 (наружный диаметр₆₀₀нм) 0,5-0,8. Используйте MEMα для нормализации среднелогарифмической культуры до наружного диаметра₆₀₀нм, равного 0,1.
5. Перенесите 150 мкл нормализованной культуры в каждую лунку 96-луночного планшета, обработанного ФАПЧ. Статическая инкубация в течение 18-20 ч в увлажненной камере при температуре 37 °C.<бр/> заметка: Биопленки также могут быть выращены в других форматах, таких как μ-канальные слайды (см. Таблицу материалов).
6. Аспирируйте надосадочную жидкость, чтобы удалить планктонные клетки. Аккуратно промойте оставшуюся биомассу 150 μл сбалансированного раствора соли Хэнкса (HBSS), чтобы удалить неприкрепленные клетки. Добавляйте HBSS по каплям, чтобы не нарушить биопленку.
   заметка: При аспирации надосадочной жидкости и HBSS во время промывки оставляйте в лунках, содержащих биопленку, достаточно жидкости (надосадочной жидкости или HBSS), чтобы биопленка все еще оставалась погруженной. Это предотвращает разрушение структуры биопленки при добавлении HBSS по каплям для промывки биопленки.
7. Повторите шаг 1.6 еще не менее двух раз, чтобы удалить все планктонные клетки. На данный момент биопленки готовы к немедленным последующим экспериментам.
   заметка: Если биопленки не используются для экспериментов с нейтрофилами, HBSS можно заменить фосфатно-соевым буфером (PBS). HBSS предпочтительнее PBS, поскольку HBSS содержит компоненты, включая глюкозу, которые обеспечивают оптимальные условия для активации нейтрофилов.

2. Выделение нейтрофилов

ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрофилы были выделены по ранее опубликованному методу с незначительными изменениями. Этот протокол изоляции сочетает в себе сначала центрифугирование с градиентом плотности, а затем 3% осаждение декстрана. В этом разделе рассматривается только общий протокол выделения нейтрофилов, уделяя особое внимание изменениям, внесенным в опубликованный протокол. Кроме того, протокол, описанный ниже, является одним из многих методов, которые могут изолировать нейтрофилы и могут быть заменены по мере необходимости. Другие методы выделения нейтрофилов включают использование сред для разделения клеток или разделения клеток магнитными антителами.

1. Возьмите кровь у взрослого донора с помощью венепункции в соответствии с протоколом, изложенным в институциональном IRB. Перед забором крови убедитесь, что шприц содержит достаточное количество гепарина, не содержащего консервантов, чтобы конечная концентрация гепарина составляла 20 Ед/мл.
2. Разбавляют гепаринизированную кровь 3/4 объема 0,9% NaCl, не содержащего эндотоксинов (см. таблицу материалов) в_H2Oпри комнатной температуре.
3. На каждые 20 мл разбавленной крови следует добавить 14 мл коммерчески доступной среды градиента плотности (см. Таблицу материалов) в свежую коническую пробирку объемом 50 мл. Тщательно выложите разведенный образец крови поверх градиентной среды плотности.
4. Центрифугируйте образец многослойной крови при плотности 400 x g в течение 40 минут при комнатной температуре. Убедитесь, что центрифуга имеет медленный перерыв, чтобы не потревожить слой после завершения центрифугирования.
   заметка: Образец крови будет состоять из пяти слоев, содержащих смесь физиологического раствора и плазмы, слой мононуклеарных клеток, среду с градиентом плотности, нейтрофилы и эритроциты.
5. С помощью серологической пипетки аспирируйте все слои над нейтрофилами и эритроцитарной гранулой, после чего мягко ресуспендируйте гранулу в холодном 0,9% NaCl, не содержащем эндотоксинов, в H₂O. Для каждой гранулы, полученной из образца крови объемом 20 мл, суспендируйте гранулу до общего объема 20 мл. Добавьте объем 1:1 3% декстрана (см. Таблицу материалов). Инкубируйте трубку в вертикальном положении в течение 18-20 минут на льду.
   заметка: Убедитесь, что 3% декстран содержит 0,9% NaCl, не содержащую эндотоксинов, в_H2O.
6. Удалите 20 мл верхнего слоя, содержащего нейтрофилы и некоторые эритроциты, на новую коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте ее при 355 x g в течение 10 минут при 4 °C. Слейте надосадочную жидкость, оставив после себя красную гранулу.
7. Аккуратно ресуспендируйте гранулу в 10 мл холодного, стерильного H₂O на 30 секунд для лизирования оставшихся эритроцитов. Немедленно добавьте в смесь 10 мл холодного раствора без эндотоксина 0,9% физиологического раствора для восстановления тонуса. Центрифугируйте раствор при 233 x g в течение 3 мин при 4 °C.
8. Слейте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу, содержащую 95%-97% нейтрофилов, в 1 мл холодного HBSS на 20 мл образца крови.
9. Перенесите 10 мкл ресуспендированных нейтрофилов в 90 мкл 0,4% трипанового синего эксклюзионного красителя и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра (см. Таблицу материалов).
   заметка: Нежизнеспособные клетки окрашиваются в синий цвет, так как трипановый синий исключающий краситель непроницаем для жизнеспособных клеток. Этот протокол обеспечивает жизнеспособность клеток на >99%.
10. Добавьте дополнительно HBSS так, чтобы конечная концентрация нейтрофилов составляла 4 x 10⁶ клеток/мл.
    заметка: В случаях с жизнеспособностью клеток <99% конечная концентрация 4 x 10⁶ клеток/мл все еще может быть достигнута; однако общий объем полученного раствора, содержащего 4 x 10⁶ клеток/мл, уменьшится. Конечная концентрация нейтрофилов может быть скорректирована в соответствии с экспериментальными потребностями пользователя. Нейтрофилы ресуспендировали в конечной концентрации 4 x 10⁶ клеток/мл для всех описанных ниже экспериментов. Чтобы учесть вариабельность от донора к донору, настоятельно рекомендуется, чтобы все эксперименты, связанные с нейтрофилами, проводились как минимум с тремя разными донорами.

3. Визуализация биопленочных взаимодействий с нейтрофилами

1. Установите биопленку, выполнив шаги 1.2-1.6. Для облегчения визуализации биопленки используйте флуоресцентный штамм S. aureus, такой как USA300, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), чтобы облегчить микроскопическую визуализацию.
   заметка: Для демонстрации модели биопленки in vitro (шаг 1) было использовано 6 μ-канального предметного стекла (см. Таблицу материалов) вместо 96-луночного планшета.
2. Инкубируйте 4 x 10⁶ клеток/мл нейтрофилов со 100 мкМ синего красителя CMAC (7-амино-4-хлорметилкумарин) (BCD, см. Таблицу материалов) в течение 30 минут в коромысле при 37 °C и 5%_CO2. Убедитесь, что образцы инкубируются в темноте, и ограничьте воздействие света на оставшиеся этапы.
3. Чтобы смыть избыток BCD, центрифугируйте нейтрофилы при 270 x g в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте нейтрофилы в свежем HBSS. На этом этапе добавьте гомодимер этидия-1 (см. Таблицу материалов) к нейтрофилам, окрашенным BCD, в конечной концентрации 4 мкМ для мониторинга гибели нейтрофилов и бактерий.
4. Добавьте 150 мкл нейтрофилов в биопленку S. aureus, выращенную в μ-слайдах, таким образом, чтобы соотношение нейтрофилов и бактерий составляло 1:30 (нейтрофилы: бактерии). Инкубируйте μ-слайды во влажной камере в течение 30 минут. Количество бактериальных клеток основано на количестве клеток, полученном при осаждении биопленки в течение 18 часов.
5. Визуализируйте взаимодействие нейтрофилов с биопленкой с использованием флуоресцентных каналов, соответствующих длинам волн возбуждения и излучения флуоресцентных красителей/белков.
   заметка: Для настоящего исследования BCD составляет 353/466 нм, гомодимер-1 этидия – 528/617 нм, а GFP – 395/509 нм. Ограничьте воздействие на образец лазера или света, чтобы предотвратить фотообесцвечивание образцов.
6. Анализируйте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений для микроскопии или таких программ, как FIJI/ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ, BAIT и многих других.
   заметка: При работе с пятнами важно учитывать специфику используемых красителей. Некоторые красители воздействуют на прокариотические и эукариотические клетки, в то время как другие воздействуют только на одну. Если нейтрофилы и биопленки окрашиваются отдельно с помощью красителей, которые могут окрашивать оба типа клеток, обязательно смойте оставшийся краситель перед объединением нейтрофилов и биопленок, чтобы предотвратить перекрестное окрашивание.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,9% хлорида натрия для орошения, USP	Бакстер	2Ф7124	Не содержит эндотоксинов; Используется для выделения нейтрофилов
Скоростной фильтрующий блок 150 мл	Термо Сайентиал	565-0020
Этанол 200 пробы	ВВР	89125-188
Шприц объемом 3 мл	БД	309657	Используется для забора крови
Конические центрифужные пробирки объемом 50 мл	Термо Сайентиал	339652
Шприц 60 мл	БД	309653	Используется для забора крови
агар	Биореагенты Фишера	БП1423-2
Спиртовой тампон	БД		Используется для забора крови
Пластыри			Используется для забора крови
BD Bacto Tryptic Соевый бульон	БД	ДФ0370-07-5	Смешайте с 1,5% агаром для получения триптического соевого агара
Счетчик ячеек	Бал Суппли	202С
CellTracker синий CMCH	Инвитроген	С2111	Синий краситель CMAC (BCD)
Плиты из полистирола с прозрачным дном 96 лунок с плоским дном	Костар	No 3370
Хлопчатобумажная марля	Фишербранд	Тел.: 13-761-52	Используется для забора крови
Пробирки для культивирования	Фишербранд	Тел.: 14-961-27	Боросиликатное стекло 13 x 100 мм
D-(+)-глюкоза	сигма	Г-8270
Декстран от Leuconostoc spp.	сигма	31392-250Г	Используется для выделения нейтрофилов
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) 1x	Gibco	14190-144
Гомодимер этидия-1	Инвитроген	Л3224 Б
Ficoll-Paque plus	Цитива	17144003	Используется для выделения нейтрофилов (градиентная среда плотности)
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-СВ	Без кальция, магния и фенола красный
Гемоцитометр	Яркая линия
Гепарин	Новаплюс	НДЦ 63323-540-57	1000 единиц USP/мл, используется для забора крови
ИМАРИС 9.8	Оксфорд Instruments		Программное обеспечение для анализа изображений для микроскопии
Минимальные необходимые носители (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
Игла (23 G1)	БД	305145	Используется для забора крови
Фотоаппарат Nikon Eclipse Ti2	Компания Nikon
Элементы НИС	Компания Nikon		Количественное определение мертвых нейтрофилов
Раствор поли-L-лизина	сигма	П4707-50МЛ
Хлорид натрия	Биореагенты Фишера	БП358-10	Используется для выделения нейтрофилов
Стерильная вода для полива, USP	Бакстер	2Ф7114	Не содержит эндотоксинов; Используется для выделения нейтрофилов
Крылатый инфузионный набор Surflo	Терумо	SC*19BLK	19 Г x 3/4", используется для забора крови
Трипановая синяя морилка (0.4%)	Gibco	15250-061
Терникат			Используется для забора крови
Ультрачистая дистиллированная вода	Инвитроген	10977015
Белые непрозрачные 96-луночные планшеты	сокол	353296	Обработанная культура тканей и плоская нижняя пластина
μ-слайд VI 0,4	Там же	80601	μ-канальная горка