Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка мышей и DSS
- Держите мышей с нокаутом (α-gustducin-/-) и мышей контрольного типа дикого типа (α-gustducin+/+) C57BL/6 по отдельности в чистых клетках.
заметка: Нокаутные мыши скрещивались с мышами C57BL/6 на протяжении более 20 поколений и имеют почти 100% генетический фон C57BL/6.
- Растворите 30 г порошка сульфата декстрана натрия (ДСС) в 1 л автоклавной воды. Перемешайте до тех пор, пока раствор не станет прозрачным, чтобы убедиться, что конечная рабочая концентрация составляет 3% (по массе).<бр/>
заметка: Раствор DSS можно хранить при комнатной температуре до 1 недели или при температуре 4 °C до использования.
2. Индукция и оценка колита DSS у мышей
- Взвесьте и запишите начальную массу тела каждой мыши. Поместите мышей по отдельности в стандартные пластиковые клетки и промаркируйте клетки.
- Замените обычную питьевую воду на 3% раствор DSS в общей сложности на 7 дней, к которому обе группы мышей имеют доступ ad libitum.
- Измеряйте массу тела мыши, записывайте расход раствора DSS, а также ежедневно собирайте и исследуйте стул каждой мыши во время введения DSS. Наблюдайте за тяжестью диареи и ректального кровотечения и преобразуйте их в индекс заболевания, вызванный DSS.
- В ходе эксперимента рассчитывается процент потери веса по сравнению с исходным весом и индекс заболеваемости для оценки симптомов колита.
заметка: Индекс заболевания оценивается путем объединения наблюдений за диареей и ректальным кровотечением и определяется следующим образом: 0 (нормальный стул, без крови), 1 (мягкий стул, без крови), 2 (мягкий стул, мало крови), 3 (очень мягкий стул, умеренное кровотечение) и 4 (водянистый стул, значительное кровотечение). Индекс заболеваемости анализируется ежедневно для каждой мыши.
- К концу 7-дневного лечения DSS принесите мышей в жертву из-за вывиха шейки матки и приступайте к оставшимся экспериментам.
3. Подготовка образцов тканей
- Поместите мышь в положение лежа на спине и очистите кожу живота 70% этанолом. Сделайте разрез средней линии длиной 3 см в области живота с помощью маленьких ножниц, чтобы обнажить брюшную полость.
- С помощью щипцов осторожно отделите селезенку от других тканей, затем удалите селезенку и измерьте ее размер.
- Определите и подтяните толстую кишку щипцами и отделите ее от окружающей брыжейки. Вытяните всю толстую кишку до тех пор, пока не станут видны слепая кишка и прямая кишка.
- Изолируйте толстую кишку, пересекая ее у колоноцекального края и глубоко в области таза, чтобы освободить проксимальный и дистальный отделы ободочной кишки соответственно. Затем измерьте и запишите длину изолированной толстой кишки. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани толстой кишки во время процедуры рассечения.
- Промойте толстую кишку 10 мл ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) с помощью шприца объемом 10 мл, оснащенного иглой для зондажа, чтобы удалить кал и кровь до тех пор, пока элюат не станет полностью прозрачным.
- Для гистологической идентификации разделите образцы тканей поровну на три части: проксимальную, среднюю и дистальную. Затем зафиксируйте ткань 4% параформальдегидом (PFA) на ночь при температуре 4 °C.
- Для анализа экспрессии цитокинов быстро заморозьте всю толстую кишку жидким азотом и храните ее при температуре -80 °C до использования.
4. Гистологическая оценка тяжести колита, вызванного DSS
- Иммуногистохимия
- После фиксации погрузите ткань в раствор 30% сахарозы в 1x PBS на ночь в пробирку объемом 15 мл для криозащиты образцов.
- Поместите ткань в состав с оптимальной температурой резки (OCT) и поместите его при температуре -20 °C до тех пор, пока OCT не затвердеет.
- Перенесите блок ОКТ, содержащий ткань, в криостат, установите шкалу толщины в криостате на 12 мкм, а затем нарежьте и соберите замороженные срезы толщиной 12 мкм.
- Нагрейте собранные срезы тканей из криостата при температуре 65 °C в течение 20 минут на горячей плите. Промыть секции в 1x PBS 3 раза, по 10 мин каждая. Инкубируйте участки тканей в 3% перекиси водорода в течение 10 мин для элиминации эндогенной пероксидазы. Промойте секции еще 3 раза. Блокируйте ткани блокирующим буфером (3% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 0,3% неионогенного моющего средства, 2% козьей сыворотки, 0,1% азида натрия в 1x PBS) при комнатной температуре в течение 1 часа или более.
- Замените блокирующий буфер раствором, содержащим следующие первичные антитела, специфичные для типа иммунных клеток: CD45 для лейкоцитов, CD3 для Т-клеток, B220 для В-клеток, CD11b для макрофагов и Ly6G для нейтрофилов. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
- Удалите первичные антитела из участков тканей с помощью аспирации. Вымойте секции 1x PBS 3 раза, по 10 минут каждая. Инкубируют срезы с биотинилированными вторичными антителами с последующей инкубацией с комплексом стрептавидин-HRP при комнатной температуре.
- Инкубируйте срезы с раствором 3,3'-диаминобензидина (DAB) для получения светло- или темно-коричневого цвета и визуализации иммунореактивных клеток.
- Срезы закрасить гематоксилином и 0,3% (v/v) разбавленным аммиаком. Делайте снимки в светлом поле с 10-кратным увеличением под микроскопом.
- Используйте программу обработки изображений для идентификации и количественной оценки популяции помеченных иммунных клеток как в эпителии, так и в собственной пластинке (под эпителием) путем установки 2 масок: используйте первую маску в функции на основе цветового куба для установки порога обнаружения цвета и измерения окрашенных DAB-реактивных областей; используйте вторую маску для определения общей площади эпителия и собственной пластинки в исследуемом участке. Экспрессию популяции иммунореактивных клеток выражают как отношение площади окрашивания инфильтрированных клеток к общей площади исследуемой ткани.
