Уничтожение клеток K562 мононуклеарными клетками периферической крови, подвергшихся воздействию препаратов табачных изделий

Аннотация

Источник: Arimilli, S. et al., Методы оценки цитотоксичности и иммуносупрессии препаратов горючих табачных изделий. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы изучаем влияние целой дымовой среды, горючего препарата табачного изделия, на уничтожение клеток K562 эффекторными мононуклеарами периферической крови.

Протокол

1. K562 Убийственный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки K562 следует выращивать в культуре при 37 °C и 5%_CO2 с полной средой RPMI до тех пор, пока они не достигнут 80% слияния перед анализом.

1. Приготовьте стоковый раствор карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE) в массе 5 мМ, добавив во флакон 18 мкл ДМСО.
2. Разбавьте WS-CM или никотин в 96-луночном планшете с использованием полной среды RPMI до общего объема 100 мкл/лунка для достижения желаемых эквиникотиновых единиц или концентраций никотина для каждой лунки><. осторожность: Никотин крайне токсичен и опасен для окружающей среды.
3. Добавьте 100 мкл PBMC в полную среду RPMI в концентрации 1,5 x 10⁶ клеток/лунку. Общий объем клеток с WS-CM или никотином составит 200 μл/лунку.
4. Накройте тарелку крышкой и выдерживайте в течение 3 часов при 37 °C и 5%_CO2.
5. Промойте ячейки K562, добавив 10 мл DPBS, и центрифугируйте при 400 x g в течение 8 минут при RT.
6. Ресуспендируйте клетки 10 мл DPBS и подсчитайте клетки K562.
7. Приготовьте рабочий раствор CFSE, добавив 1 мкл стокового раствора CFSE в 1 мл DPBS.
8. Добавьте 1 мл рабочего раствора CFSE к 1 мл клеточной суспензии K562, содержащей 1 - 2 x 10⁷ клеток. Сделайте вихрь и инкубируйте точно в течение 2 минут при RT.
9. Сразу же добавьте 200 μл FBS. Сделайте вихрь и инкубируйте точно в течение 2 минут при RT.
10. Добавьте 10 мл полной среды RPMI и центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 8 минут при RT.
11. Удалите надосадочную жидкость RPMI, разбейте гранулу и снова суспендируйте клетки 10 мл полной среды RPMI и подсчитайте клетки K562, меченные CFSE.
12. Промойте PBMC, центрифугируя планшет при 300 x g в течение 3 минут в RT. Отсадите надосадочную жидкость, сцеживая жидкость. Установите на место крышку и закрутите нижнюю часть пластины. Добавьте 200 μл готовой среды RPMI и повторите этап промывки еще раз.
13. Добавьте меченые CFSE клетки K562 в соотношении 1:15 (100 000 K562s:1,5 x 10⁶ PBMCs) в каждую лунку для отбора проб планшета PBMC и далее инкубируйте в течение 5 часов при 37 °C и 5%_CO2.
14. Промойте клеточную смесь центрифугированием при 300 x g в течение 3 минут в RT. Аспирируйте надосадочную жидкость, выбросив жидкость. Поместите крышку и закрутите дно тарелки.
15. Добавьте 200 μл рабочего буфера и повторите этап промывки, описанный в шаге 14, еще раз.
16. Добавьте 95 μл рабочего буфера, а затем 5 μл 7AAD в каждую лунку, чтобы получить общий объем 100 μл/лунку. Инкубируйте тарелку в темноте при RT в течение 15 минут.
17. Добавьте 100 мкл проточного буфера в каждую лунку и перенесите весь объем клеточной суспензии из каждой лунки планшета в кластерные пробирки и соберите образцы на проточном цитометре.
18. Определите процент 7AAD-положительных и CFSE-положительных клеток с помощью программного обеспечения для анализа проточной цитометрии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12 трубок по 75 штук	BD Falcon	352058
Конические тубы 15 мл	Корнинг	430790 (Английский
2 мл микропробирок	Аксиген	MCT-150-C-S
Конические тубы 50 мл	Корнинг	430828
Флакон 500 мл	Корнинг	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
96-луночная пластина с плоским дном	Termo Nunc	439454
96-луночные круглые донные пластины	BD Falcon	353077
Колпак для клеточных культур	Термо Сайентиал	Серия 1300 A2
центрифуга	Эппендорф	58110Р
CFSE	Молекулярные зонды Life Technologies	С34554
Кластерные трубки	Корнинг	4401	Вреден при проглатывании, канцероген
ДМСО (диметилсульфоксид)	Сигма-Олдрич	Д8418
ДПБС	Лонза	17-512Ф
ФБС	Сигма-Олдрич	Ф2442
Фильтрующий блок	Налген	156-4020
Проточный цитометр	BD Biosciences	FACS Песнь II	8 цветов на длинах волн Ex 405 нм и Em785 нм.
Проточный цитометр	BD Biosciences	FACS Calibur	4 цвета на Ex 495 нм и Em 785 нм.
Программное обеспечение для анализа проточной цитометрии	Древовидная звезда	ФлоуДжо
никотин	Сигма-Олдрич	Н3876	Острая токсичность, опасность для окружающей среды
Парафильм	Бемис	«М»
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	П6148	Легковоспламеняющиеся, Раздражение кожи
Ручка/стрептококк	Технологии Gibco Life	15140-122
РПМИ 1640	Технологии Gibco Life	11875-093
Работающий буфер	Беговой буфер MACS, Miltenyi Biotech	Тел.: 130-091-221
Трансферная пипетка	Научный центр Фишера	Телефонный номер 13-711-20
База Трис	Сигма-Олдрич	Т1503

)