1. Готовим синтетическую среду для муковисцидоза (SCFM2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка SCFM2 состоит из трех основных этапов, описанных ниже (Рисунок 1).
- Стерилизация свиного муцина
- Приготовьте стерильный муцин в конечной концентрации 5 мг/мл в SCFM2. Например, для объема 5 мл SCFM2 взвесьте 25 мг муцина типа II в стерильной чашке Петри и поместите его в ультрафиолетовый (УФ) стерилизатор на 4 часа, осторожно перемешивая каждый час.
- Через 4 ч перенесите обработанный УФ-излучением муцин в автоклавированные пробирки объемом 1,7 мл в стерильных условиях и храните при температуре -20 °C.
- Чтобы подтвердить полную стерилизацию, растворите образец муцина в стерильной жидкости, такой как вода или бульон Лурия-Бертани (LB), и понаблюдайте под микроскопом><.
заметка: Стерилизованный муцин может храниться при температуре -20 °C до 6 месяцев.
- Приготовление буферной основы
- Приготовьте исходные растворы солей и аминокислот, добавив соответствующие весовые количества в деионизированную воду, как указано в таблице 1. Отфильтровать и стерилизовать все исходные растворы с помощью фильтра 0,22 мкм, завернуть в фольгу для защиты от легкой деградации и хранить при температуре 4 °C до одного месяца.
- Приготовьте буферизованное основание, соединив 190 мл деионизированной воды с растворами аминокислот и солевых запасов в объемах, указанных в таблице 1. Отрегулируйте раствор до pH 6,8 и увеличьте до конечного объема 250 мл. Отфильтруйте и стерилизуйте с помощью фильтра 0,22 мкм и храните при температуре 4 °C до 30 дней.
- Вечером накануне эксперимента насыпьте желаемое количество буферизованного основания в стеклянную колбу для культуры и добавьте муцин (5 мг/мл, как описано в шаге 1.1.1) и очищенную ДНК спермы лосося (0,6 мг/мл). Осторожно перемешайте, заверните в фольгу и оставьте при температуре 4 °C на ночь, чтобы муцин и ДНК растворились в растворе><.
заметка: Аликвоты ДНК спермы лосося следует разморозить на льду, завихрить и добавить к буферному основанию и муцину. Исходные растворы триптофана, аспарагина и тирозина должны быть приготовлены в растворах NaOH (концентрации см. в таблице 1) вместо деионизированной воды. Храните буферную основу и все исходные растворы завернутыми в фольгу для защиты от воздействия света. Большинство акций будут стабильны до месяца. Обесцвеченные приклады не следует использовать и перед использованием их следует заменить.
- Добавление дополнительных запасов
- В день проведения эксперимента добавьте перечисленные в таблице 2 запасы к буферному основанию, содержащему муцин и ДНК.
заметка: Свежий раствор FeSO4 приготовьте в день эксперимента, но все остальные запасы можно сделать заранее и хранить в течение 30 дней при 4 °C. 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DOPC) содержит хлороформ. Обращайтесь с осторожностью и не используйте вблизи открытого огня. После добавления DOPC инкубировать SCFM2 при 37 °C с встряхиванием (250 об/мин) в течение не менее 20 мин (для культуры 5 мл). Этот инкубационный период позволяет хлороформу, содержащемуся в ДОПК, испаряться. Колба не должна быть герметичной; Вместо этого неплотно накройте отверстие колбы фольгой.
2. Оценка толерантности к противомикробным препаратам в бактериальных агрегатах в реальном времени
- Подготовка культур на ночь
- Вечером накануне эксперимента инокулируйте 5 мл бульона LB несколькими колониями Pa PAO1-pMRP9-113 из агаровой пластины LB, содержащей антибиотик (карбенициллин 300 мкг/мл). Выращивание за ночь при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин.<бр/>
заметка: Выращивайте культуры в ночное время с добавлением антибиотиков, необходимых для отбора необходимых плазмид (в данном случае плазмида экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), pMRP9-1). Обратите внимание, что Па-клетки должны быть промыты перед инокуляцией SCFM2. LB может быть заменен другими богатыми лабораторными средами для ночных культур. Со всеми бактериальными изолятами следует обращаться с использованием соответствующих рекомендаций BSL-2 в рамках данного протокола.
- Инокуляция SCFM2
- В день эксперимента в течение ночи разбавляют культуры Па 1:10 (культура: жидкие среды) путем инокуляции 500 мкл в 5 мл свежего бульона LB. Выращивайте клетки до логарифмической фазы (60-90 мин) при 37 °C с перемешиванием при 250 об/мин.
- Центрифугируйте культуры в логарифмической фазе при 10 000 × г в течение 5 мин. Промойте клетки, удалив надосадочную жидкость и повторно суспендируя их в 3 мл стерилизованного фильтром фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,0). Повторите два раза и снова суспендируйте гранулу в окончательном объеме 1 мл PBS.
- Измерьте абсорбцию отмытых клеток с помощью спектрофотометра при длине волны 600 нм (OD600) и рассчитайте объем культуры, необходимый для начального OD600 0,05 в 5 мл SCFM2. Введите Pa в SCFM2 и осторожно внесите вихрь, чтобы распределить клетки по всему периметру. Пипетку по 1 мл инокулированного SCFM2 ввести в каждую камеру 4-луночного оптического стакана со стеклянным дном и инкубировать в течение 4 ч при температуре 37 °C.
заметка: Время удвоения культур Pa зависит от штамма и доступности кислорода. В SCFM2 при описанных здесь условиях время удвоения Pa составляет ~1,4 ч.
3. Визуализация агрегатов во время лечения антибиотиками с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается использование конфокального лазерного сканирующего микроскопа и программного обеспечения для захвата изображений для визуализации Pa-агрегатов в SCFM2. Цель состоит в том, чтобы наблюдать и характеризовать остаточную (толерантную) бактериальную биомассу после лечения антибиотиками. Описанные шаги могут быть успешно выполнены на других конфокальных микроскопах, хотя для получения конкретных рекомендаций следует обращаться к руководству по эксплуатации прибора.
- Культуре Pa с использованием нагреваемой камеры или нагретого микропланшета, установленного на предметном столике микроскопа, для поддержания температуры окружающей среды 37 °C. Запустите инкубационный модуль не менее чем за 2 ч до начала эксперимента, чтобы позволить всему аппарату достичь желаемой температуры и уменьшить дальнейшее расширение и перемещение во время сбора данных.
- Через 4 ч перенесите культуры SCFM2, содержащие Па-клетки, на нагретый предметный столик микроскопа. Определите 3 из 4 лунок в качестве технических репликатов для лечения антибиотиками, а 4-ю лунку рассмотрите как контрольную скважину без лечения, содержащую только Pa-клетки в SCFM2, без антибиотиков. Идентифицируйте агрегаты с помощью светлопольной микроскопии на вкладке «Найти» до возбуждения флуоресцентных репортеров. Определите область для визуализации в каждой скважине и сохраните ее положение (координаты x-y-z) с помощью модуля «Положения» в программном обеспечении для обработки изображений.
- Используйте 63-кратный масляный иммерсионный объектив для визуализации культур Pa, содержащих экспрессию GFP плазмиды pMRP9-1 в SCFM2 с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 509 нм. Делайте снимки с помощью опции z-stack в модуле «Съемка» с интервалом 1 мкм (всего 60 срезов). Используйте модуль Усреднение линий для уменьшения фоновой флуоресценции в канале GFP в пределах общего объема изображений z-стека размером 60 мкм (1 093,5 мм3). Получение контрольных изображений неинокулированных SCFM2 с использованием идентичных настроек для определения фоновой флуоресценции для анализа изображений.
заметка: Изображения получаются путем создания 8-битных изображений Z-стека размером 512 x 512 пикселей (0,26 мкм x 0,26 мкм) с Z-стеком, которые находятся на расстоянии 60 мкм от основания покровного стекла.
- Используйте опцию временных рядов в программном обеспечении для обработки изображений, чтобы захватить 60 срезов в каждой позиции (лунке) с интервалом в 15 минут в течение 18 часов. Используйте определенную стратегию фокусировки в программном обеспечении для хранения фокальной плоскости для каждой позиции, к которой возвращаются в каждую точку времени на протяжении всего эксперимента.
- После 4,5 часов инкубации визуализируйте каждое положение с использованием вышеуказанных настроек, чтобы определить совокупную биомассу в каждой из четырех лунок перед добавлением антибиотика.
- Через 6 ч после полной инкубации добавьте антибиотик в концентрации в 2 раза ниже минимальной ингибиторной концентрации (МИК) к каждой реплике. Аккуратно впрыскивайте пипетку прямо в середину лунки, чуть ниже межфазного соединения воздух-жидкость. Поддерживайте все культуры в отапливаемой конфокальной камере.
заметка: Здесь использовали сульфат колистина в концентрации 140 мкг/мл.
- Начните визуализацию постантибиотического лечения, нажав на опцию «Начать эксперимент» в программе визуализации.
заметка: Используемая концентрация антибиотика зависит от антибиотика, изолята Па и от того, хочет ли пользователь исследовать эффекты убийства или толерантности. В этом эксперименте используется однократная доза. При необходимости можно добавлять дополнительные дозы без нарушения бактериологического культивирования.
4. Окрашивание йодидом пропидия агрегатов Pa
ПРИМЕЧАНИЕ: Йодид пропидия (PI) обычно используется в качестве окрашивающего реагента для идентификации нежизнеспособных (мертвых) бактериальных клеток в культуре. В данном случае он используется для идентификации агрегатов, чувствительных к лечению антибиотиками, применяемыми в разделе 3. В рамках этого протокола экспрессия и обнаружение GFP в клетках Pa используется в качестве основного показателя жизнеспособности клеток. Этот заключительный шаг позволяет снова использовать конфокальную визуализацию для определения пространственного позиционирования живых/мертвых агрегатов по отношению друг к другу. Кроме того, агрегаты идентифицируются как живые/мертвые для дальнейшей сортировки клеток в разделе 3.
- Через 18 ч добавьте PI в каждую лунку четырехкамерного оптического донного чаши, содержащего культуры SCFM2. Следуйте инструкциям производителя в отношении объема ПИ и времени инкубации (например, ~2 μL на мл культуры, ~20-30 минут).
5. Выделение живых клеток из агрегатов с помощью метода сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS)
ПРИМЕЧАНИЕ: FACS представляет собой мощную платформу для сортировки и изоляции групп клеток в соответствии с флуоресцентно помеченным фенотипом. В данном случае FACS используется для выделения живых (устойчивых к антибиотикам) агрегатов от нежизнеспособных агрегатов.
- После окрашивания йодидом пропидиума извлеките культуры из инкубации и переложите в прибор FACS в изолированном контейнере для поддержания температуры 37 °C.
- Пропустите 1 мл аликвот SCFM2, содержащих агрегаты Pa, с наименьшим расходом.
заметка: Каждая аликвота будет содержать ~15 000 агрегатов.
- Чтобы обнаружить GFP, осветите ячейки лазером с длиной волны 488 нм и зарегистрируйте высоту флуоресцентного сигнала на длине волны 530/30 нм. Визуализируйте окрашивание PI возбуждением с помощью лазера с длиной волны 561 нм и зарегистрируйте высоту флуоресцентного сигнала на длине волны 610/20 нм. Выполнить сортировку с помощью сопла 70-u.<бр/>
заметка: Отсортированные агрегаты могут быть объединены в пул несколькими способами в зависимости от приложения пользователя. В этом случае FACS был использован для сортировки жизнеспособных агрегатов Pa для последующего секвенирования РНК.
Таблица 1: Приготовление запасов соли, аминокислот, ДНК и муцина, необходимых для буферного основания синтетической среды мокроты муковисцидоза, SCFM2.
См.
См.
мм
См.
См.
См.
| химический | Концентрация запаса (м) | Конечная концентрация (мМ) | примечания |
| 2PO4 | 0,2 | 1.3 | |
| Na2HPO4 | 0,2 | 1.25 | |
| КНО3 | 1 | 0,35 | |
| К2СО4 | 0,25 | 0,27 | |
| NH4Cl | | 2.28 | Добавляйте твердое вещество непосредственно в буферизованное основание |
| KCl | | 14.94 | Добавляйте твердое вещество непосредственно в буферизованное основание |
| NaCl | | 51,85 | Добавляйте твердое вещество непосредственно в буферизованное основание |
| Швабры | | 10 | Добавляйте твердое вещество непосредственно в буферизованное основание |
| Сир | 0,1 | 1.45 | |
| Glu HCl | 0,1 | 1.55 | |
| профессионал | 0,1 | 1.66 | |
| Гли | 0,1 | 1.2 | |
| Ала | 0,1 | 1.78 | |
| Валь | 0,1 | 1.12 | |
| встреченный | 0,1 | 0,63 | |
| Иль | 0,1 | 1.12 | |
| лей | 0,1 | 1.61 | |
| Orn HCl | 0,1 | 0,68 | |
| Лис гидрохлорид | 0,1 | 2.13 | |
| Arg HCl | 0,1 | 0,31 | |
| Трп | 0,1 | 0,01 | Приготовлено в 0,2 м NaOH |
| гадюка | 0,1 | 0,83 | Готовится в 0,5 м NaOH |
| Тир | 0,1 | 0,8 | Приготовлено в 1,0 М NaOH |
| Тр | 0,1 | 1.07 | |
| Cys HCl | 0,1 | 0,16 | |
| Пхе | 0,1 | 0,53 | |
| Его HCl H2O | 0,1 | 0.52 | |
| ДНК спермы лосося | | 0,6 мг/мл | |
| Свиной муцин | | 5 мг/нл | |
Таблица 2: Приготовление дополнительных запасов, необходимых для буферного основания синтетической среды мокроты муковисцидоза, SCFM2.
См.
| химический | Концентрация материала (М) | Конечная концентрация (мМ) | примечания |
| Декстроза (D-glu2cose) | 1 | 3 | |
| L-молочная кислота | 1 | 9,3 | Настройка pH до 7,0 с помощью NaOH |
| CaCl2*H2O | 1 | 1,75 | |
| MgCl2*6H2O | 1 | 0,61 | |
| FeSO4*7H2O | 1 мг/мл | 0,0036 | Готовьте свежее ежедневно |
| N-ацетилглюкозамин | 0,25 | 0,3 | |
| 1,2-диолеол-sn-глицеро-3-фосфоколин (DOPC) | 25 мг/мл | 100 мкг/мл | После добавления инкубировать не менее 20 мин при 37 °C |
