$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка клеток к инфекции
- Пропагандируйте мышиную макрофагоподобную клеточную линию RAW 264.7 в среде для культуры тканей DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (далее DMEM/FCS) с использованием колбы объемом 125 мл и инкубатора для культуры тканей, поддерживаемого при температуре 37 °C/5%CO2.
- За день до заражения с помощью скребка для клеток удалите клетки из расширительной колбы и соберите их в коническую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл. Центрифугируют клетки при 800 х г в течение 10 мин, сцеживают надосадочную жидкость, суспендируют клеточную гранулу в 1 мл DMEM/FCS (без антибиотиков) и определяют титр с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
- Отрегулируйте титр до 2 x 106 клеток/мл и добавьте 0,10 мл (2 x 105 клеток) в лунки 48-луночной чашки для культивирования тканей. Следите за тем, чтобы клеточная суспензия покрывала всю поверхность лунки.
- Пластинчатые ячейки в дополнительных скважинах для последующего источника кондиционированных сред. Кроме того, поместите 0,10 мл DMEM/FCS в три дополнительные лунки, чтобы они служили «контролем без клеток».
- Инкубировать в течение ночи в инкубаторе для тканевых культур при 37 °C/5%CO2. На следующий день не вынимайте из инкубатора до тех пор, пока бактерия не будет подготовлена и готова к использованию.
2. Подготовка Listeria monocytogenes (Lm) к инфекции
- Введите 2 мл инфузии мозг-сердце (BHI) одной колонией из только что обработанного агарового планшета (<2 дня) Lm и инкубируйте в течение ночи при 37 °C с встряхиванием со скоростью 130 оборотов/мин.
- На следующий день добавьте 0,10 мл ночной культуры к 2 мл предварительно подогретого BHI и продолжайте инкубацию при 37 °C с встряхиванием до тех пор, пока оптическая плотность (OD600) не составит от 0,4 до 0,6.
- Определите примерный титр бактерий с помощью эмпирически выведенной формулы пересчета. В нашей лаборатории экспоненциально растущая Lm культура в BHI составляет примерно 1,3 x 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) на600 OD. Сведите к минимуму время, в течение которого бактериальные культуры подвергаются воздействию комнатной температуры.
- Непосредственно перед заражением отрегулируйте титр до 5 x 107 КОЕ/мл, используя предварительно подогретый DMEM/FCS в качестве разбавителя.
3. Заражение
- Работая быстро и точно, добавьте 20 мкл (1 x 106 КОЕ; кратность инфекции, MOI = 5) свежеприготовленного инокулюма Lm (шаг 2.4 выше) в лунки, слегка наклонив чашку и осторожно поместив наконечник пипетки в вышележащую среду;
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения наконечником пипетки к стенкам лунки.
- Осторожно пипетируйте содержимое каждой лунки, чтобы обеспечить полное перемешивание; не трясите и не наклоняйте пластину слишком сильно, так как это приведет к распространению Lm по стенкам лунки. Верните чашку для клеточных культур в инкубатор с температурой 37 °C / 5%CO2.
- Приготовьте раствор гентамицина в концентрации 10 мкг/мл, используя в качестве разбавителя кондиционированную среду из неинфицированных лунок.
- Через 30 минут после заражения (MPI) осторожно добавьте 30 μL раствора гентамицина (конечная концентрация 2,5 μг/мл) и аккуратно отпижьте содержимое лунки, как и до этого, верните чашку для клеточных культур в инкубатор с температурой 37 °C/5%CO2.
- При давлении 60 MPI подготовьте подходящие лунки для анализа КОЕ (временная точка 60 mpi) или анализа FCM (как описано ниже в разделах 4 и 5 соответственно).
- Для остальных лунок в разное время после этого либо забирают клетки, как и раньше, либо, для анализа на выход Lm, полностью удаляют среду из лунки и заменяют ее 150 мкл кондиционированной среды, не содержащей гентамицина.
4. Обработка проб и анализ внутриклеточного и эмерджентного Lm методом анализа КОЕ
- Для сбора урожая слегка наклоните посуду и аккуратно выньте весь фильтрующий материал из лунки. Добавьте в колодец 0,50 мл дистиллированной стерильной воды (dsH2O). Через 30 с перенесите полученный лизат воды (100) в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и энергично переведите в течение 10 с.
- Приготовьте разбавления 10-1 и 10-2, добавив 4,5 мкл или 50 мкл лизата воды к 450 мкл dsH2O и кратковременно завихрите, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
- Распределите 50 мкл образцов 100, 10-1 и/или 10-2 на агаровые планшеты лизогенного бульона (LB).
- Для определения эмерджентного Lm (шаг 3.6 выше) удалите 10 мкл перекрывающей среды и разделите ее на две аликвоты по 5 μL: к одной аликвоте добавьте 5 μL DMEM/FCS и ко второй аликвоте добавьте 5 μL DMEM/FCS, содержащей 5 μг/мл гентамицина. Последний контроль различает внеклеточный Lm (чувствительный к гентамицину) и внутриклеточный Lm (устойчивый к гентамицину) в последующем анализе на КОЕ.
- Через 5 минут при комнатной температуре добавьте 90 μL dsH2O, энергично перемешайте в течение 10 секунд и распределите 50 μL на агаровых пластинах LB.
- Перечислите колонии Lm на агаровых планшетах LB после 2 дней инкубации при 37 °C.