Анализ методом проточной цитометрии внутриклеточных и эмерджентных внеклеточных Listeria monocytogenes in vitro

Аннотация

Источник: Гейл,. и др., Использование бактериального патогена для зондирования клеточных и организменных реакций хозяина. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы количественно оцениваем внутриклеточные и внеклеточные Listeria monocytogenes, внутриклеточные патогенные бактерии, после их инфицирования культивируемых макрофагов in vitro с помощью проточной цитометрии.

Протокол

1. Выборка, обработка и анализ внутриклеточных и эмерджентных LM с помощью проточной цитометрии (FCM)

1. Приготовьте мышиную макрофагоподобную клеточную линию RAW 264.7 в среде для культуры тканей DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (далее DMEM/FCS) с использованием колбы объемом 125 мл и инкубатора для культуры тканей, поддерживаемого при температуре 37 °C/5%_CO2. Доведите клетки до 1 x 10⁶ клеток/мл и добавьте 1 мл (1 x 10⁶ клеток) в лунки 6-луночной чашки для культивирования тканей.
2. Получить Listeria monocytogenes, Lm, бактерию инокулята и заразить клетки объемом инокулюма, соответствующим MOI 50 (5 x 10⁷ КОЕ).
3. Через 1,5 часа после заражения (hpi) соберите среду из первого набора лунок и поместите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) и поместите на лед до тех пор, пока все лунки не будут обработаны.
4. Для сбора внутриклеточного Lm добавьте в лунку 1 мл ds H₂O и через 60 с перенесите полученный лизат воды в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 500 мкл 4% PFA. Энергично завихрить в течение 10 секунд и поместить на лед до тех пор, пока все лунки не будут обработаны.
5. Для оставшихся лунок удалите среду и замените 1 мл DMEM/FCS на 5 мкг/мл гентамицина, чтобы убить внеклеточный Lm и быстро вернуть клетки в инкубатор.
6. Через 30 минут (2 hpi) удалите среду и замените на DMEM/FCS без гентамицина.
7. Через 2 и 4 ч (4 и 6 hpi) возьмите вторую и третью временные точки, собирая среды и лизаты.
8. Центрифужные пробирки при давлении 10 000 x g в течение 7 мин. Удалите надосадочную жидкость, не повреждая гранулы.
9. Суспендируйте каждую гранулу в окрашивающем коктейле из 50 мкл 4% PFA и 15 мкл фаллоидина. Инкубируйте пробирки в темноте при температуре 4 °C в течение 20 минут.
10. После инкубации добавьте 1 мл буфера FACS в каждую пробирку и пипетку вверх и вниз для смешивания.
11. Вращайте трубки при давлении 10 000 x g в течение 7 мин. Удалите надосадочную жидкость, не повреждая гранулы.
12. Суспендируйте каждую гранулу в 400 мкл буфера FACS для немедленного использования или в 200 мкл буфера FACS и 200 мкл 4% PFA при хранении для последующего анализа.
13. Запустите образцы на проточную цитометрию и проанализируйте собранные данные.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Бульон BHI (Brain Heart Infusion)	EMD Milipore	110493
Сетчатый фильтр, 70 μм	ВВР	10199-656 (Английский)
Коллагеназа D	Рош	11088858001
DMEM медиа	Gibco	11965-092 Номер 11965-092
Трубки FACS	BD Falcon	352054
FBS - термоинактивированный	Сигма-Олдрич	Ф4135-500МЛ
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса	Сигма-Олдрич	Х6648-6С500МЛ
ЛБ агар	Растительные клетки РС	МБПЭ-4040
LIVE/DEAD Исправляемый набор для удаления желтых мертвых клеток	Технологии Life	Л349С9
Родамин фаллоидин	Термо Фишер	Р415
Спектральный анализатор SP6800	сони
Тканевые культуры ТПП 48-луночные планшеты	МИДСКИ	TP92048
6-луночные планшеты для тканевой культуры TPP	МИДСКИ	TP92406