1. Собираем и готовим мух
- Задняя часть Drosophila melanogaster в желаемых экспериментальных условиях. Следите за тем, чтобы мухи не переселялись во время выращивания, и убедитесь, что плотность личинок одинакова при разных видах лечения, поскольку условия окружающей среды на личиночной стадии могут сильно повлиять на фенотипы иммунной защиты во взрослой стадии.
- Соберите экспериментальных мух через 0 - 3 дня после выведения из куколки и перенесите их на свежую среду.
- Держите собранных мух при желаемой температуре (обычно подходит температура от 22 °C до 28 °C) до тех пор, пока они не состарятся через 5 - 7 дней после экклозии><.
заметка: Это дает достаточно времени для того, чтобы мухи завершили метаморфоз и стали зрелыми взрослыми особями, но это происходит задолго до начала старения.
- Перед заражением отсортируйте нужное количество мух в отдельный флакон, опять же стараясь не допустить переполнения.
заметка: В этой демонстрации заражаются только самцы, но в равной степени возможно заразить самок с помощью описанной процедуры.
2. Культивирование и подготовка бактерий
- Подготовьте мастер-пластину из выбранных бактерий не менее чем за 2 дня до заражения. Разрежьте бактерии из 15% глицеринового запаса, хранящегося в течение неопределенного времени при -80 °C. Храните эталонную пластину при температуре 4 °C до 2 недель. Всегда нарезайте мастер-пластины непосредственно из замороженного глицеринового бульона. Избегайте последовательного прохождения бактерий от планшета к планшету, так как повторное прохождение в культуре может привести к тому, что бактерии разовьют ослабленную вирулентность.
заметка: В этом примере используются Providencia rettgeri и Escherichia coli.
- Используйте следующую процедуру для приготовления бактериальной суспензии для инъекций.
- Вырастите культуру бактерий объемом 2 мл путем инокуляции стерильной среды с одной колонией, выделенной из эталонной пластины. Доведите бактерии до стационарной фазы (например, рост O/N при 37 °C).
заметка: И P. rettgeri, и E. coli хорошо растут в бульоне Luria при температуре от 20 до 37 °C при осторожном встряхивании.
- После того, как культура достигнет стационарной фазы, аккуратно гранулируйте клетки примерно из 600 мкл культуры в настольной центрифуге (3 мин при 5000 x g), отбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте бактерии примерно в 1000 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS; 137 мМ хлорида натрия, NaCl, 2,7 мМ хлорида калия, KCl, 10 мМ фосфат натрия, Na2PO4, 1,8 мМ дигидрофосфат калия, KH2PO4, pH = 7,4).
- Разбавляйте ресуспендированные клетки в стерильном PBS для достижения оптической плотности (OD), подходящей для используемой бактерии, измеряемой спектрофотометром в качестве поглощения при длине волны 600 нм. Используйте эту суспензию для заражения мух.
заметка: A 600 = 0,1 или 1,0 соответствует соответственно приблизительно 108 и 109 Providencia rettgeri или E. coli на мл. Поскольку как живые, так и мертвые бактерии вносят свой вклад в оптическую плотность, важно собирать культуры на ранних стадиях стационарной фазы, прежде чем трупы бактерий накапливаются и искажают соотношение между оптической плотностью и количеством жизнеспособных бактерий, введенных во время инфекции.
3. Заразить мух
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку иммунитет дрозофилы зависит от циркадного ритма, важно проводить инфекции в одно и то же время суток у экспериментальных реплик.
- Использование наноинъектора
- Подготовьте стеклянные иглы к инфицированию.
- Подготовьте стеклянную иглу, потянув за капилляр боросиликатного стекла с помощью съемника микропипетки.
- С помощью щипцов отломите кончик иглы, чтобы создать отверстие диаметром примерно 50 мкм, позволяющее выталкивать жидкость.
- Соберите инжектор.
- Поместите уплотнительное кольцо, а затем белую распорку (большую ямочку, обращенную наружу) на металлический поршень.
- Наполните стеклянную иглу минеральным маслом с помощью шприца с иглой 30 G.
- Вставьте заполненную стеклянную иглу в цангу, а затем поместите большее уплотнительное кольцо вокруг ее основания, примерно в 1 мм от тупого конца иглы.
- Наденьте иглу на металлический поршень и аккуратно закрутите цангу до упора.
- Вытолкните большую часть минерального масла из инжектора, но убедитесь, что в игле все еще есть небольшой объем масла, который будет действовать как барьер между инжектором и бактериальной суспензией. Убедитесь, что в минеральном масле или бактериальной суспензии, а также между этими двумя жидкостями нет пузырьков воздуха.
- Установите инжектор на нужный объем для впрыска (от 9 до 50 нл).
- Создание средств управления ранами.
- Заполните инъекторную иглу стерильным PBS, осторожно вставив кончик капиллярной иглы в трубку со средой и нажав кнопку "заполнить" на инжекторе.
заметка: Стерильные бактериальные среды для выращивания также могут быть использованы в качестве средства контроля ран, если эксперимент требует введения бактерий, взвешенных в питательной среде. Однако, поскольку бактериальная питательная среда содержит компоненты, которые могут стимулировать иммунную систему или оказывать другое воздействие на хозяина, инертный носитель, такой как PBS, является предпочтительным.
- Обезболите нужное количество мух под легким потоком углекислого газа (СО2).
- Вводите мухам в переднюю часть брюшной полости на вентролатеральной поверхности стерильный PBS.
заметка: Также возможно введение мух в другие места, такие как стерноплевральная пластинка грудной клетки, но важно, чтобы место инъекции было постоянным в рамках каждого эксперимента.
- Поместите введенных мух в свежие флаконы с новой средой, положив флаконы на бок до тех пор, пока все мухи не оправятся от анестезии, чтобы предотвратить прилипание мух к пище.
заметка: Рекомендуется вводить PBS контрольным мухам перед введением бактерий подопытным мухам, чтобы одна и та же игла могла использоваться для обоих обработок. Не всегда будет возможность использовать одну и ту же иглу для всего эксперимента. В этом случае может быть желательно зафиксировать, какая игла использовалась с какими мухами, и включить идентификацию иглы в качестве экспериментального фактора в статистический анализ.
- Введите бактериальный патоген.
- Извлеките остатки стерильных сред из инъектора и снова наполните ту же иглу бактериальной суспензией.
- Повторите описанную выше процедуру (3.1.3), теперь вводя мухам бактериальную суспензию, приготовленную в процедуре 2.2.
