1. Собираем и готовим мух
- Задний D. melanogaster в желаемых экспериментальных условиях. Следите за тем, чтобы мухи не переселялись во время выращивания, и убедитесь, что плотность личинок одинакова при разных видах лечения, поскольку условия окружающей среды на личиночной стадии могут сильно повлиять на фенотипы иммунной защиты во взрослой стадии.
- Соберите экспериментальных мух через 0 - 3 дня после выведения из куколки и перенесите их на свежую среду.
- Держите собранных мух при желаемой температуре (обычно подходит температура от 22 °C до 28 °C) до тех пор, пока они не состарятся через 5 - 7 дней после экклозии><.
заметка: Это дает достаточно времени для того, чтобы мухи завершили метаморфоз и стали зрелыми взрослыми особями, но это происходит задолго до начала старения.
- Отсортируйте нужное количество мух в отдельный флакон перед заражением, опять же стараясь избежать переполненности.
заметка: В этой демонстрации заражаются только самцы, но в равной степени возможно заразить самок с помощью описанной процедуры.
2. Культивирование и подготовка бактерий
- Подготовьте эталонную пластину из выбранных бактерий не менее чем за 2 дня до заражения. Разрежьте бактерии из 15% глицеринового запаса, хранящегося в течение неопределенного времени при -80 °C. Храните эталонную пластину при температуре 4 °C до 2 недель. Всегда нарезайте мастер-пластины непосредственно из замороженного глицеринового бульона. Избегайте последовательного прохождения бактерий от планшета к планшету, так как повторное прохождение в культуре может привести к тому, что бактерии разовьют ослабленную вирулентность.
заметка: В этом примере используются Providencia rettgeri и Escherichia coli.
- Используйте следующую процедуру для приготовления бактериальной суспензии для инъекций.
- Вырастите культуру бактерий объемом 2 мл путем инокуляции стерильной среды с одной колонией, выделенной из эталонной пластины. Доведите бактерии до стационарной фазы (например, рост O/N при 37 °C).
заметка: И P. rettgeri, и E. coli хорошо растут в бульоне Luria при температуре от 20 до 37 °C при осторожном встряхивании.
- После того, как культура достигнет стационарной фазы, аккуратно гранулируйте клетки примерно из 600 мкл культуры в настольной центрифуге (3 мин при 5000 x g), отбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактерии в ок. 1000 мкл стерильного фосфатного буферного раствора (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2PO4, 1,8 мМ KH2PO4, pH = 7,4).
- Разбавляйте ресуспендированные клетки в стерильном PBS для достижения оптической плотности (OD), подходящей для используемой бактерии, измеряемой спектрофотометром в качестве поглощения при длине волны 600 нм. Используйте эту суспензию для заражения мух.
заметка: А600 = 0,1 или 1,0 соответствует соответственно приблизительно 10,8 и 10,9 Providencia rettgeri или E. coli на мл. Поскольку как живые, так и мертвые бактерии вносят свой вклад в оптическую плотность, важно собирать культуры на ранних стадиях стационарной фазы, прежде чем трупы бактерий накапливаются и искажают соотношение между оптической плотностью и количеством жизнеспособных бактерий, введенных во время инфекции.
3. Заразить мух
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку иммунитет дрозофилы зависит от циркадного ритма, важно проводить инфекции в одно и то же время суток у экспериментальных реплик.
- С септиком Pinprick
- Подготовьте иглу к проколу.
- Расплавьте конец наконечника для микропипетки объемом 200 мкл и вставьте в расплавленный пластик булавку размером 0,15 мм. Дайте пластику затвердеть таким образом, чтобы штифт удерживался на месте на расстоянии примерно 0,5 см от штифта.
- Создание средств управления ранами.
- Обезболите нужное количество мух под легким потокомСО2.
- Прокалывайте мушки в грудиноплевральную пластинку грудной клетки иглой, избегая мест прикрепления крыльев и ног. При необходимости аккуратно удалите мушки с мельчайшего булавки с помощью мягких щипцов.
заметка: Также можно колоть мух в других местах, таких как передняя часть брюшной полости на вентролатеральной поверхности, но важно, чтобы место инъекции было постоянным в каждом эксперименте. Прокалывание кутикулы живота, как правило, сложнее, чем прокалывание грудной клетки, и поэтому встречается реже.
- Поместите уколовшихся мух в свежий флакон с новой средой для мух, положив флакон на бок, пока все мухи не оправятся от анестезии, чтобы предотвратить прилипание мух к пище.
- Занесите бактериальную инфекцию.
- Обезболите нужное количество мух под легким потокомСО2.
- Проколите каждую муху в том же месте, где находится контроль среды, погрузив кончик штифта в бактериальную суспензию, приготовленную в соответствии с процедурой 2.2, прежде чем уколоть каждую муху.
- Поместите уколовшихся мух в свежий флакон с новой средой для мух, положив флакон на бок, пока все мухи не оправятся от анестезии, чтобы предотвратить прилипание мух к пище.