Измерение бактериальной нагрузки E. coli у Drosophila melanogaster после инфекции E. coli

Аннотация

Источник: Khalil, S., et al. Фенотипы системной бактериальной инфекции и иммунной защиты у Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2015)

В этом видео мы демонстрируем метод измерения бактериальной нагрузки E. coli после введения E. coli в грудную клетку Drosophila melanogaster.

Протокол

1. Анализ бактериальной нагрузки после инфекции

1. Измерьте бактериальную нагрузку.
   1. В назначенное время после инъекции поместите каждую муху в микроцентрифужную пробирку на льду.
   2. Добавьте 250 μl PBS в каждую пробирку и гомогенизируйте мух с помощью пестика или взбивателя для бисера.
   3. Нанесите гомогенат на пластину из агара LB с помощью спирального платера или последовательного разведения.
      1. Для нанесения пластин с использованием последовательного разведения перенесите каждый гомогенат мухи в первый ряд 96-луночного планшета.
      2. Заполните каждую лунку из оставшихся рядов 90 μл PBS.
      3. С помощью многоканальной пипетки возьмите 10 мкл из первого ряда, содержащего гомогенат мухи, и распределите во второй ряд.
      4. Пипеткой вверх и вниз не менее 10 раз тщательно перемешать, а затем взять 10 мкл и переложить на третий ряд. Повторите эту процедуру, используя оставшиеся ряды.
      5. Начиная с нижнего ряда (большинство разбавленных бактериальных суспензий), используйте многоканальную пипетку, чтобы взять 10 мкл из каждой лунки и нанести на планшет LB, следя за тем, чтобы образцы распределялись в виде дискретных пятен, которые не соприкасаются друг с другом. Повторяйте до тех пор, пока не будут отобраны все лунки из каждого ряда, распределяя их в порядке убывания разбавления на пластине LB.
      6. Оставьте пластину в положении RT до тех пор, пока пятна полностью не впитаются в пластину LB.
         заметка: Перед использованием рекомендуется высушить планшет LB в течение нескольких дней в режиме RT, чтобы жидкость легко впитывалась, сводя к минимуму вероятность случайного контакта между пятнами образца.
   4. Инкубируйте пластины O/N, стараясь не перерастать пластины, чтобы колонии оставались маленькими и дискретными.
      заметка: В зависимости от используемой питательной среды для бактерий и температуры инкубации на пластине могут появиться колонии, полученные из эндогенной микробиоты кишечника мухи. Тем не менее, большинство бактерий, используемых для патогенной инфекции, растут гораздо быстрее, чем микробиота кишечника на LB-агаре при 37 °C.
   5. Извлекайте планшеты из инкубатора, когда экспериментальные бактерии создадут видимые колонии (обычно через 8–12 часов), но до появления колоний кишечной микробиоты дрозофилы (примерно через 36 часов). Для медленно растущих экспериментальных бактерий используйте селективный антибиотик в LB-агаре для удаления любых колоний из микробиоты кишечника.
   6. Подсчитайте количество колоний для каждого гомогената.
      1. Для спиральных пластин подсчитайте колонии, которые растут, с помощью автоматического счетчика колоний, который может оценить бактериальную нагрузку на мл гомогената на основе количества и положения колоний на пластине><. ПРИМЕЧАНИЕ: Спиральный подсчет является наиболее точным, когда концентрация бактерий находится в диапазоне от 5 x 10² до 5 x 10⁴ бактерий на мл.
      2. Для точечных пластин вручную подсчитайте колонии для каждой мухи из того разведения, которое содержит 30 - 300 колоний, и рассчитайте количество бактерий на мл исходного гомогената.
2. Проанализируйте данные.
   1. Если бактериальная нагрузка ненормальна, либо преобразуйте данные, чтобы лучше аппроксимировать нормальное распределение, либо проанализируйте данные с помощью непараметрического статистического анализа (например, U-критерия Манна-Уитни). Используйте анализ Бокса-Кокса для поиска оптимального преобразования; Преобразования естественного логарифма или основания -10 логарифм часто оказываются эффективными.
   2. Если данные распределены достаточно нормально и сравниваются только два метода лечения, проведите t-критерий, чтобы определить, приводят ли эти два лечения к разным средним бактериальным нагрузкам. Если существует несколько экспериментальных переменных или других потенциально прогностических факторов, используйте дисперсионный анализ (ANOVA), чтобы определить, какие факторы являются значимыми предикторами бактериальной нагрузки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашки Петри с прозрачными крышками, приподнятым гребнем; 100 x 15 мм;	VWR международный	25384-302 (Английский)
Л.Б. Агар, Миллер	Дифко	No 244520 (Английский
Петля инокуляции	VWR международный	80094-488
Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл; Обряд печати	США Сайнтикал Инк.	1615-5500
моторизованный пестик; Лабораторная мешалка Talboys	Троемнер	103
Высокопроизводительный гомогенизатор Talboys	Диагностика OPS	930145
5/32'' Мелющие шары	Диагностика OPS	ГБСС 156-5000-01
Вихревой джинн	Scientific indurstries inc.	Г560
Многоканальный дозатор (10 мкл-300 мкл)	Сарториус	730360 (Английский
WASP2 Whitley Автоматизированный спиральный платер	Международная организация «Микробиология
ProtoCOL Автоматизированный счетчик колоний / счетчик пластин / считыватель пластин	Международная организация «Микробиология
инкубатор	Пауэрс Сайентикул, Инк	DROS52SD