Анализ для определения инфекционной дозы вируса дрозофилы С в культивируемых клетках насекомых

Аннотация

Источник: Yang, S. et al., Установление вирусной инфекции и анализ взаимодействия хозяина и вируса у Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019)

В этом видео мы демонстрируем анализ цитопатического эффекта для определения инфицирующей дозы вируса Drosophila C в тканевой культуре на клетках Drosophila S2*. Для инфицирования культивируемых клеток используются различные концентрации вируса. Определена доля клеток, проявляющих структурные изменения, и эти данные используются для расчета инфекционной дозы культуры тканей.

Протокол

1. Измерение нагрузки вируса С дрозофилы C методом анализа CPE

1. Выберите 5 случайных вируссодержащих пробирок для определения средней инфекционной дозы вирусной культуры ткани (TCID₅₀) с помощью анализа цитопатического эффекта (CPE) (1 единица TCID₅₀ = 0,7 единицы, образующей бляшки [PFU]).
   заметка: CPE относится к структурным изменениям в клетках хозяина, вызванным вирусной инвазией. Заражающий вирус вызывает лизис клетки-хозяина или когда клетка умирает без лизиса из-за неспособности к размножению.
2. В 1-й день собрать подготовленные S2* клетки методом пипетирования. Посчитайте номер ячейки. Центрифугируйте ячейки по 300 х г в течение 4 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Разбавьте элементы до плотности 1 x 10⁶ клеток/мл с полной средой для S2* клеток.
3. Засейте 1 x 10⁵ S2*клеток (100 μл) на лунку в плоскодонную 96-луночную пластину (~30% конфлюенции).
4. Выполнение последовательных 10-кратных разведений материала DCV с полной средой для ячеек S2*. Добавьте в лунку разведение по 50 μл. Добавьте 50 мкл питательной среды без вируса в лунку, классифицируемую как лунка отрицательного контроля.
   заметка: Для каждой степени разубоживания использовали 8 скважин. Поскольку типичный выход DCV составляет около 10^{8-10 9} БОЕ/мл, разведение должно охватывать по крайней мере ~10^−5-10−10.
5. На 4-й день наблюдайте за CPE с помощью светлопольного микроскопа с объективом 20X или 40X. Классифицируйте лунку, в которой клетки выглядят размытыми, а среда полна фрагментов, как «положительную лунку», а лунку, в которой морфология клеток нормальная, как «отрицательную лунку».
6. Пометьте положительные или отрицательные скважины CPE знаком + или –, соответственно. Рассчитайте вирус TCID₅₀ по методу Рида и Мюнха.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл	клеймо	No 352070 (Английский
Чашка для клеточных культур 10 см	сигма	CLS430167	Культура клеток
Клеточный инкубатор	Саньо	МИР-553
центрифуга	Эппендорф	5810Р
центрифуга	Эппендорф	5424Р
Инкубатор дрозофил	Персиваль	И-41NL	Выращивание дрозофилы
ФБС	Инвитроген	12657-029 (Английский)	Культура клеток
Среда для насекомых Шнайдера	сигма	С9895	Культура клеток
Статистическое программное обеспечение	ГрафПад Призма 7
Плоскодонный 96-луночный планшет	сигма	CLS3922	Культура клеток
Клеточный инкубатор	Саньо	МИР-553
микроскоп	Олимп	СКХ41

)