Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Сбор урожая костного мозга
- Асептически удалите бедренную и большеберцовую кости у мыши и очистите кости с помощью стерильных инструментов. Поместите очищенные кости в модифицированную орлиную среду Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазина-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) + 0,2 мг/мл L-глутамина + 0,05 мМ 2-меркаптоэтанол + 50 мг/мл гентамицина сульфата + 10 000 Ед/мл пенициллина/стрептомицина + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, DMEM-10 complete) и инкубируйте пробирку на льду в течение 15 минут.
- Удалите проксимальные и дистальные шаровые шарниры с помощью ножниц. Введите иглу 25 G, прикрепленную к шприцу объемом 10 мл, наполненному средой, в углубление костей. Промойте костный мозг с помощью DMEM-10 complete. Восстановите суспендию комков, аккуратно пипетируя среду вверх и вниз.
- Центрифугируйте клетки в течение 10 мин при давлении 300 x g и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. На этом этапе либо заморозьте клетки с использованием 90% FBS + 10% диметилсульфоксида (ДМСО), либо поместите клетки в чашку Петри диаметром 15 см для дифференцировки макрофагов с использованием кондиционированной среды L929 (шаг 2.1).
2. Дифференцировка макрофагов, полученных из костного мозга
- Используя предварительно подогретую среду для дифференцировки (21 мл DMEM-10 complete и 9 мл L929 кондиционированной среды, как описано Swanson et al.), поместите клетки костного мозга в чашку Петри размером 15 см (1,2-1,5 x 107 клеток) размером 15 см. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5% углекислом газе, илиCO2, в течение 7 дней. Добавьте в планшет еще 30 мл дифференцировочной среды на 3 или 4 день.
заметка: Важно не использовать планшеты, обработанные культурой тканей, так как макрофаги будет трудно отделить и собрать.
- Для сбора макрофагов промойте планшет фосфатно-солевым буфером (PBS) и добавьте 20 мл холодной PBS + 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Инкубируйте тарелку при температуре 4 °C в течение 10 минут. Соберите клетки, нанеся на клетки пипетирование PBS + EDTA и промойте планшет 10 мл PBS. Соедините обе промывки в две конические пробирки объемом 15 мл.
- Центрифугируйте клетки при 300 х г в течение 10 мин и ресуспендируйте клетки в 10 мл фенол-красного свободного DMEM + 5 мМ HEPES + 0,2 мг/мл L-глутамина + 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола + 5% FBS (DMEM-5) и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или счетчика Култера. Во время подсчета держите клетки на льду.
- Засейте макрофаги в планшетах, покрытых тканевыми культурами, в концентрации 2 x 105 клеток/мл. Для экспериментов с микроскопией засейте 1 мл клеток на покровных стеклах в 24 луночных планшета. Для анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) засейте 100 мкл клеток в 96-луночный планшет. Для анализа LDH засеивают 9 лунок (3 лунки необработанные, 3 лунки со 100% контролем лизиса и 3 лунки для экспериментального стимула).
- Центрифугируйте 96-луночный планшет в течение 5 минут при 300 x g, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределены по лунке.
- Перед началом процесса грунтовки выдержите планшет в течение ночи при температуре 37 °C + 5%CO2.
3. Грунтовка
- Замените среду на свежую среду (DMEM-5), содержащую 100 нг/мл липополисахарида или ЛПС (500 мкл для 24-луночного планшета или 50 мкл для 96-луночного планшета).
заметка: Существует множество структурных вариаций ЛПС, которые влияют на способность стимулировать TLR4-опосредованный прайминг. LPS от Salmonella minnesota R595 (Re) доступен у нескольких поставщиков и рекомендуется.
- Инкубируйте планшет в течение 3 ч при 37 °C и 5% CO2.
4. Активация инфламмасомы NLRP3 с помощью нигерицина и мечение с помощью FAM-YVAD-FMK
- Удалите среду и замените ее 290 мкл DMEM-5, содержащим 5 мкМ нигерицина и 5 мМ глицина. Глицин добавляется для уменьшения количества лизиса клеток, который происходит при активации каспазы-1. Инкубировать в течение 60 мин при 37 °C и 5% CO2. Используйте макрофаги как дикого типа, так и макрофаги с дефицитом каспазы-1, чтобы убедиться, что наблюдаемая маркировка специфична для каспазы-1.
- В течение последних 45 минут добавьте 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK, приготовленного в соответствии с инструкциями производителя.
- Через 60 мин удалите среду и промойте клетки три раза по 5 мин каждый 1 мл холодного PBS.
- Добавьте в каждую лунку 250 мкл 2% параформальдегида и выдерживайте на льду, покрытом алюминиевой фольгой, в течение 30 минут.
- В течение последних 5 минут добавьте 4 мкл 0,2 мМ красного флуоресцентного красителя нуклеиновой кислоты для мечения ядер. 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) или другие красители также могут быть использованы для мечения ДНК.
- Трижды промойте ячейки 1 мл холодной PBS и закрепите покровные стекла на предметных стеклах микроскопа с помощью монтажной среды объемом 7 μл, препятствующей выцветанию. Дайте монтажной среде застыть в течение ночи, прежде чем приклеить покровное стекло к предметному стеклу микроскопа с помощью лака для ногтей.
- Визуализируйте макрофаги с помощью конфокальной микроскопии. Ex/Em для FAM-YVAD-FMK составляет 492/520 нм и 642/661 для дальнего красного флуоресцентного окрашивания нуклеиновых кислот. Убедитесь, что микроскоп установлен таким образом, чтобы на необработанных клетках не было фонового окрашивания в канале 488. В противном случае будет обнаружено фоновое окрашивание FAM-YVAD-FMK, а не собственно активная каспазаза-1.
5. Визуализация меченых макрофагов с помощью конфокальной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные клетки можно увидеть после того, как покровные стекла затвердели в течение ночи и были запечатаны на предметном стекле микроскопа лаком для ногтей. Здесь описывается визуализация с помощью конфокального микроскопа. Клетки также можно рассмотреть с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии.
- Поместите предметное стекло с необработанными контрольными клетками на предметный столик микроскопа и сфокусируйте микроскоп на клетках.
- Используя настройки таблицы поиска (LUT) микроскопа, отрегулируйте смещение таким образом, чтобы в необработанных клетках не было положительного окрашивания FAM-YVAD-FMK. Этот процесс также может быть выполнен с использованием макрофагов с дефицитом каспазы-1.
заметка: Смещение должно быть скорректировано для каждого канала, используемого в эксперименте, но настройка правильного смещения наиболее критична для канала FAM-YVAD-FMK и каналов флуоресцентных антител. Смещение для канала ДНК менее критично. После установки смещения не изменяйте эту настройку до конца эксперимента.
- Переключите предметное стекло на образец, обработанный нигерицином. Найдите поле, содержащее как положительные, так и отрицательные клетки для окрашивания FAM-YVAD-FMK. Настройте плоскость изображения канала FAM-YVAD-FMK в плоскость с наибольшей интенсивностью положительного окрашивания. Обычно это плоскость, в которой отображается центр очага воспаления.
- Отрегулируйте усиление таким образом, чтобы очаги были видны в клетках с конденсированными ядрами. После установки усиления и смещения оставьте эти настройки до конца сеанса работы с изображением.
заметка: Один из простых способов определить, является ли клетка пироптотической, — это изучить морфологию ядра. Клетки с активной каспазой-1 имеют округлые и конденсированные ядра, в то время как ядрышки видны в клетках без активации каспазы-1, а морфология ядра аналогична таковой у необработанных клеток.
- Соберите изображения 5 случайно выбранных полей с общим увеличением 100X. Обычно это приводит к примерно 40 ячейкам на изображение. Повторите этот процесс для каждого образца.
- Подсчитайте количество ячеек на каждом изображении с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Затем подсчитайте количество клеток, которые имеют положительное окрашивание FAM-YVAD-FMK. Представляйте уровень активации каспазы-1 в процентном соотношении к FAM-YVAD-FMK положительным клеткам.
