$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Дифференцировка макрофагов, полученных из костного мозга
- Используя предварительно подогретую среду для дифференцировки (21 мл DMEM-10 complete и 9 мл L929 кондиционированной среды, как описано Swanson et al.), поместите клетки костного мозга в чашку Петри размером 15 см (1,2-1,5 x 107 клеток) размером 15 см. Инкубируйте планшет при 37 °C и 5%CO2 в течение 7 дней. Добавьте в планшет еще 30 мл дифференцировочной среды на 3-й день или 4,<бр/>
заметка: Важно не использовать планшеты, обработанные культурой тканей, так как макрофаги будет трудно отделить и собрать.
- Для сбора макрофагов промойте планшет фосфатно-солевым буфером (PBS) и добавьте 20 мл холодной PBS + 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Инкубируйте тарелку при температуре 4 °C в течение 10 минут. Соберите клетки, нанеся на клетки пипетирование PBS + EDTA и промойте планшет 10 мл PBS. Соедините обе промывки в две конические пробирки объемом 15 мл.
- Центрифугируйте клетки при 300 х г в течение 10 мин и ресуспендируйте клетки в 10 мл фенол-красного свободного DMEM + 5 мМ HEPES + 0,2 мг/мл L-глутамина + 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола + 5% FBS (DMEM-5) и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или счетчика Култера. Во время подсчета держите клетки на льду.
- Засейте макрофаги в планшетах, покрытых тканевыми культурами, в концентрации 2 x 105 клеток/мл. Для экспериментов с микроскопией засейте 1 мл клеток на покровных стеклах в 24 луночных планшета. Для анализа высвобождения ЛДГ засейте 100 мкл клеток в 96-луночный планшет. Для анализа LDH засеивают 9 лунок (3 лунки необработанные, 3 лунки со 100% контролем лизиса и 3 лунки для экспериментального стимула).
- Центрифугируйте 96-луночный планшет в течение 5 минут при 300 x g, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределены по лунке.
- Перед началом процесса грунтовки выдержите планшет в течение ночи при температуре 37 °C + 5%CO2.
2. Прайминг
- Замените среду на свежую среду (DMEM-5), содержащую 100 нг/мл ЛПС (500 мкл для 24-луночного планшета или 50 мкл для 96-луночного планшета).
заметка: Существует множество структурных вариаций ЛПС, которые влияют на способность стимулировать TLR4-опосредованный прайминг. LPS от Salmonella minnesota R595 (Re) доступен у нескольких поставщиков и рекомендуется.
- Инкубируйте планшет в течение 3 ч при 37 °C и 5% CO2.
3. Активация инфламмасомы NLRP3 нигерицином
- Удалите среду и замените ее 290 мкл DMEM-5, содержащим 5 мкМ нигерицина и 5 мМ глицина. Глицин добавляется для уменьшения количества лизиса клеток, который происходит при активации каспазы-1. Инкубировать в течение 60 мин при 37 °C и 5% CO2. Используйте макрофаги как дикого типа, так и макрофаги с дефицитом каспазы-1, чтобы убедиться, что наблюдаемая маркировка специфична для каспазы-1.
- Через 60 мин удалите среду и промойте клетки три раза по 5 мин каждый 1 мл холодного PBS.
4. Окрашивание антителами
ПРИМЕЧАНИЕ: Пометить клетки антителами для обнаружения ASC, посева, прайма и воздействия на клетки нигерицина, идентичного предыдущему разделу. Последующая обработка происходит следующим образом:
- Промойте ячейки три раза по 5 мин каждый 1 мл холодного PBS. Добавьте 250 мкл раствора для фиксации и пермеабилизации. Инкубируйте клетки на льду, и накройте крышкой на 30 минут.
- Промойте макрофаги три раза в течение 5 минут каждый с 1 мл буфера для промывки.
- Добавьте 250 мкл первичного антитела против ASC, разведенного в соотношении 1:500 в буфере для промывки, и инкубируйте в течение 1 ч на льду. Включите в комплект один покровный листок, который не получает никаких первичных антител, а будет получать только вторичные. Этот покровный колпачок будет использоваться во время настройки микроскопа для установки правильного смещения.
- Промойте ячейки три раза в течение 5 минут каждая с буфером для промывки объемом 1 мл.
- Добавьте 250 μл вторичного антитела (флуоресцентный краситель конъюгированный коза-антимышь), разведенного в соотношении 1:500 в промывном буфере и инкубируйте в течение 1 ч на льду. Добавьте 4 мкл 0,2 мМ дальнего красного флуоресцентного красителя для нуклеиновых кислот в течение последних 5 минут такой инкубации для мечения ядер.
- Промойте ячейки 3 раза 1 мл буфера для холодной промывки и закрепите покровные стекла на предметных стеклах микроскопа с помощью монтажной среды объемом 7 μл, предотвращающей выцветание. Дайте монтажной среде застыть в течение ночи, прежде чем приклеить покровное стекло к предметному стеклу микроскопа с помощью прозрачного лака для ногтей.
- Получение изображений макрофагов с помощью конфокальной микроскопии. Ex/Em для вторичного антитела составляет 555/580 нм и 642/661 для дальнего красного флуоресцентного окрашивания нуклеиновых кислот.