Анализ высвобождения лактатдегидрогеназы для выявления гибели макрофагов после воздействия нигерицина

Аннотация

Источник: den Hartigh, A.B. et al., Обнаружение активации инфламмасом и гибели пироптотических клеток в макрофагах, полученных из костного мозга мышей. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует анализ лактатдегидрогеназы для обнаружения опосредованной инфламмасомами гибели макрофагов. Макрофаги подвергаются воздействию липополисахарида для прайминга, а затем воздействию нигерицина, вызывающего гибель клеток, вызванную инфламмасомами, которая определяется с помощью анализа лактатдегидрогеназы.

Протокол

1. Анализ высвобождения ЛДГ

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа высвобождения LDH засейте клетки в 96-луночный планшет. Не удаляйте среду после грунтования.

1. Замените среду свежей средой (DMEM-5: 10 мл фенол-красного свободного DMEM + 5 мМ HEPES + 0,2 мг/мл L-глутамина + 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола + 5% FBS), содержащей 100 нг/мл ЛПС в лунках, содержащих адгезивные макрофагальные клетки (500 мкл для 24-луночных планшетов или 50 мкл для 96-луночных планшетов).
   заметка: Существует множество структурных вариаций ЛПС, которые влияют на способность стимулировать TLR4-опосредованный прайминг. Рекомендуется использовать ЛПС из Salmonella minnesota R595 (Re).
2. Инкубируйте планшет в течение 3 ч при 37 °C и 5% CO₂.
3. Добавить 50 мкл DMEM-5, содержащего 10 мкМ нигерицина, в экспериментальные лунки и 50 мкл DMEM-5 в лунки для контроля спонтанного и 100% лизиса. Инкубировать в течение 60 мин при 37 °C и 5% CO₂.
4. Через 30 минут добавьте 10 μL 10-кратного буфера для лизиса в 100% контрольные лунки для лизиса и добавьте 10 μL DMEM-5 в другие лунки. Во время этой инкубации извлеките из морозильной камеры 1 флакон субстратной смеси (1,5 мл субстрата) и 1 аликвоту буфера для анализа (~12 мл) и дайте им оттаять в защищенном от света месте до комнатной температуры><. заметка: Субстратная смесь содержит соль тетразолия (йодонитротетразолия фиолетового), которая преобразуется в красный продукт формазана.
5. После 60-минутной общей инкубации центрифугируйте планшет в течение 5 минут при 500 x g при 10 °C. Перенесите 50 μL надосадочной жидкости на прозрачную планшет с плоским дном. В течение этого времени добавьте 12 мл пробирного буфера в флакон с субстратной смесью и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут перед использованием.
6. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл субстрата и выдерживайте 30 минут в темноте. Включите лунки только для средних значений для пустых значений. Проверьте табличку через 15 минут, чтобы убедиться, что сигнал не превысит предел обнаружения считывателя номерных знаков.
7. Через 30 минут добавьте 50 μL стоп-раствора (1 М уксусной кислоты) и измерьте внешний диаметр₄₉₀ с помощью планшетного ридера.
8. Рассчитайте процент лизиса клеток по следующей формуле:
   % цитотоксичности = ((экспериментальный - спонтанный)/(максимальный - спонтанный))×100
   Экспериментальные: клетки, обработанные нигерицином; спонтанные: необработанные клетки; Максимум: клетки, подвергшиеся воздействию буфера для лизиса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Цитотокс96 Анализ нерадиоактивной цитотоксичности	Научный центр Фишера	ПР-Г1780	Включает в себя смесь субстрата и буфер для анализа; Фирменные рецептуры. Стоп-раствор составляет 1 М уксусной кислоты
ДМЭМ, высокий уровень глюкозы, без глутамина, без фенола красного	Инвитроген	31053028
PBS Дульбекко, без кальция, без магния	Инвитроген	14190144
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, происхождение из США	Инвитроген	26140079	Инактивация при нагревании при 55°C в течение 50 минут
Гентамицин	Инвитроген	15750060
Сверхчистый ЛПС от Salmonella minnesota R595 (Re)	Список биологических препаратов	434
Считыватель пластин Spectramax M3	Молекулярные приборы	5000414
L-глютамин	Инвитроген	21051024