Индукция и визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов в предварительно меченых нейтрофилах

Аннотация

Источник: Arends, E. J. et al., Высокопроизводительный анализ для оценки и количественного определения образования внеклеточной ловушки нейтрофилов.J. Vis. Exp.(2019)

Это видео демонстрирует индукцию и визуализацию внеклеточных ловушек нейтрофилов или НЭО в предварительно меченых нейтрофилах с использованием сыворотки пациента, содержащей антинейтрофильные цитоплазматические антитела. Кроме того, использование непроницаемого красителя ДНК и флуоресцентной микроскопии позволяет визуализировать НВЛ.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.

1. Выделение здоровых нейтрофилов

1. Получите 20 мл периферической крови от здорового донора в двух пробирках, покрытых этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) по 10 мл.
2. Поместите 10 мл крови в стерильную пробирку объемом 50 мл и добавьте фосфатно-солевой буфер (PBS) в количестве до 32,5 мл.
3. Добавьте градиент плотности (например, Ficoll-amidotrizoaat) под клетками.
   1. Примите 14 мл градиента плотности с помощью пипетки объемом 10 мл и контроллера пипетки.
   2. Поместите пипетку на дно пробирки объемом 50 мл.
   3. Снимите контроллер пипетки с пипетки, позволив градиенту плотности вытекать из пипетки под действием силы тяжести до тех пор, пока не будет достигнут максимум за счет капиллярного эффекта (останется 1-2 мл), не используя двигатель.
   4. Извлеките пипетку, положив большой палец на верхнюю часть пипетки, тем самым предотвратив утечку градиента плотности во время извлечения пипетки.
4. Вращайте трубки в течение 20 минут при 912 x g и комнатной температуре (RT) без ускорения и торможения.
   Эритроциты (эритроциты) и нейтрофилы имеют высокую плотность и находятся на дне пробирки объемом 50 мл. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) разделены и расположены на вершине градиента плотности в виде белого кольца. Разбавленная PBS плазма будет выше PBMC. При необходимости PBMC можно выделить, перенеся белое кольцо в новую пробирку объемом 50 мл с дополнительными этапами промывки фосфатно-солевым буфером (PBS).
5. Сначала осторожно удалите белое кольцо, содержащее PBMC, затем удалите разбавленную PBS плазму и, наконец, слой градиента плотности, насколько это возможно.
6. Чтобы выделить нейтрофилы из смеси нейтрофилов/эритроцитов, лизируйте эритроциты холодной стерильной дистиллированной водой.
   1. Возьмите из холодильника холодную стерильную бутылку с дистиллированной водой и 10-кратную концентрированную колбу PBS.
   2. Работайте над этим шагом быстро. Добавьте 36 мл холодной стерильной дистиллированной воды непосредственно поверх гранулы и тщательно перемешайте один раз. Добавьте 4 мл 10x PBS через 20 с, чтобы получить изотонический раствор. Тщательно перемешайте один раз.
   3. Спиновая трубка в течение 5 минут при 739 x g и 4 °C (для удаления эритроцитов). Нейтрофилы будут находиться в белой грануле.
   4. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Выполните шаг 1.6.2 еще раз и убедитесь, что гранула правильно подвешена.
   5. Вращайте трубку в течение 5 минут при 328 x g и 4 °C.
   6. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл PBS. Подсчитайте нейтрофилы и держите их на льду.
      Примечание: Ожидаемый выход из 1 пробирки крови (10 мл) составляет примерно 15-75 миллионов нейтрофилов.

2. Маркировка нейтрофилов красными флуоресцентными клетками

1. Сделайте суспензию нейтрофилов из 10-20 миллионов нейтрофилов в 2 мл PBS в пробирке объемом 15 мл.
2. Приготовьте раствор 2 мл PBS с 4 мкл красного флуоресцентного линкера клеток 2 мкМ (см. Таблицу материалов) в другой пробирке объемом 15 мл. Аккуратно добавьте это в суспензию нейтрофилов и тщательно перемешайте.
3. Инкубируйте в темноте ровно 25 минут при 37 °C, чтобы пометить нейтрофилы красным флуоресцентным линкером клеток.
4. Инактивируйте мечение, добавив среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, содержащую 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS) в дозе RT до 15 мл, и тщательно перемешайте один раз. Убедитесь, что пеллета аккуратно ресуспендирована, если пеллета образовалась.
5. Вращайте трубку в течение 5 минут при 328 x g и RT.
6. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 5 мл феноловой среды RPMI 1640, содержащей 2% FBS и 10% пенициллина/стрептомицина (P/S) в RT. Подсчитайте нейтрофилы.
   заметка: Потеря клеток на 50% может произойти после мечения красными флуоресцентными клетками.

3. Индукция образования внеклеточной ловушки нейтрофилов

1. Изготовьте клеточную суспензию размером 0,42 x 10⁶ клеток/мл в среде RPMI 1640, не содержащей фенола красного цвета, содержащую 2% FBS и 10% P/S.
2. Добавьте 37 500 нейтрофилов в 90 мкл на лунку в черную 96-луночную пластину с плоским дном.
3. Добавьте 10 мкл выбранного стимула (например, сыворотки пациента) в трех экземплярах, чтобы достичь концентрации 10% в лунке. Всегда включайте отрицательный контроль (средний) в трех экземплярах.
4. Инкубируйте в темноте при температуре 37 °C в течение желаемого времени, от 30 минут до 2, 4 или 6 часов. Рекомендуется инкубировать в течение 4 часов.
5. Рассчитайте объем, необходимый для добавления 25 мкл 5 мкМ непроницаемого красителя ДНК (см. Таблицу материалов) для достижения конечной концентрации 1 мкМ в лунке. При необходимости проводят предварительное разведение в среде RPMI 1640, содержащей 2% FBS и 10% P/S до получения концентрации 5 μM.
6. Добавьте 25 мкл 5 мкМ непроницаемого красителя ДНК за 15 мин до окончания времени инкубации. Продолжайте инкубацию еще 15 минут при температуре 37 °C в темноте.
7. Очень осторожно удалите надосадочную жидкость (~125 μл) и при необходимости храните ее. Добавьте 100 мкл 4% параформальдегида (PFA). Держите в темноте и сразу же перейдите к шагу 4.

4. Визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) с помощью 3D иммунофлуоресцентной конфокальной микроскопии с высоким содержанием и высоким разрешением

1. Настройте параметры на иммунофлуоресцентном конфокальном микроскопе, нажав на настройку «Сбор».
   1. Перейдите на вкладку «Настроить».
   2. Выберите объектив и камеру. Выберите объектив 10X Apo Lambda с режимом захвата конфокального отверстия 60 μм.
   3. Нажмите на «Пластина» и выберите 96-луночную пластиковую пластину. Выберите сайты для посещения и выберите фиксированное количество сайтов. Заполните 3 столбца и 3 строки без перекрытия (0 мкм), которые покрывают в общей сложности 45% лунки.
   4. Нажмите на «Приобретение». Выберите «Включить лазерную фокусировку». При необходимости выберите «Получить Z-серию/временной ряд».
   5. Нажмите на Автофокус сайта.
      1. Нажмите на Фокус на дне пластины | Смещение по толщине дна. Чтобы в начальной скважине можно найти пробу, выбирают первую добытую скважину. Для автофокуса сайта выбирайте все сайты.
   6. Нажмите на «Длины волн».
      1. В качестве количества длин волн выберите 2. Для уровня уточнения коррекции затенения TL выберите 2.
      2. В поле Длина волны 1 выберите Texas Red.
         1. Для опций автофокусировки выберите лазер со смещением Z, смещение постлазера 1,1 мкм. Используйте Z-стек с пользовательским диапазоном 200-10.
      3. Для длины волны 2 выберите флуоресцеин изотиоцианат (FITC).
         1. Для опций автофокусировки выберите лазер со смещением по оси Z от w1 0 μm. Используйте Z-стек с пользовательским диапазоном 200-10.
         2. В качестве параметров сбора данных выберите серию Z и максимум 2D-проекционного изображения. Для выбора параметров приобретения выберите Коррекция затенения | Выкл.
   7. Выберите серию Z. Выберите количество шагов: 10. Выберите размер шага: 3 мкм (общий диапазон будет 27 мкм).
2. Поместите пластину в иммунофлюоресцентную конфокальную микроскопию.
   1. Перейдите на вкладку «Выполнить».
      1. Заполните название и описание тарелки и выберите место хранения.
      2. Выберите скважины, которые необходимо приобрести.
3. Выберите время выдержки для Texas Red и FITC.
4. Нажмите на кнопку «Получить номер», чтобы начать сбор, который займет примерно 1 час на каждый номер.

5. Анализ формирования NET

1. Используйте программу обработки изображений, предназначенную для анализа научных многомерных изображений (см. Таблицу материалов), для анализа формирования NET.
2. Перенесите полученные данные изображения на отдельный жесткий диск.
3. Выберите инструмент добавления цвета.
   1. Выберите w1 и выберите папку на жестком диске, в которой хранятся данные.
   2. Выберите w2 и выберите папку на жестком диске, в которой хранятся данные.
      заметка: Используйте стандартный макрос, который использует w1 в имени файла для добавления красного цвета к изображениям Texas Red и w2 для добавления зеленого цвета к изображениям FITC.
4. Выберите Макрос анализа.
   1. Выберите w1 и выберите пороговое значение (порог интенсивности), которое обычно равно 10. Выберите желаемое значение в пикселях (порог размера, например, 100).
   2. Выберите w2 и выберите пороговое значение (порог интенсивности), которое обычно равно 10. Выберите желаемое значение пикселя (порог размера, например, 500).
   3. Выберите место назначения файла электронной таблицы, запустите анализ и сохраните файлы журнала.
5. Анализируйте данные в электронной таблице.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аквастерильный H2O	Б. Браун, Мельзунген, Германия	12604052
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Bodinco, Алкмар, Нидерланды		При использовании в высоких концентрациях он может влиять на образование НВЛ
Ficoll 5,7% - амидотризоат 9% плотность 1,077 г/мл	LUMC, Лейден, Нидерланды	97902861
Иммунофлуоресцентный конфокальный микроскоп	Микроконфокальный аппарат Image Xpress (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США)
Нейтрализация PBS (10x)	Gibco, Пейсли, Великобритания	70011-036
Пенициллин/стрептомицин (/с)	Gibco, Пейсли, Великобритания	15070063
Фенол без красных RPMI 1640 (1 шт.)	Gibco, Пейсли, Великобритания	11835-063	Феноловый красный может мешать сигналу иммунофлюоресценции
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Б. Браун, Мельзунген, Германия	174628062
PKH26 2 мкМ Красный флуоресцентный клеточный линкер	Сигма Олдрич Сент-Луис, Миссури, США	PKH26GL-1КТ	PKH — это запатентованные флуоресцентные красители и технология маркировки клеток, названная в честь их первооткрывателя Пола Карла Хорана
Программа для научного анализа многомерных изображений	ImageJ, Отделение исследовательских услуг, Национальный институт психического здоровья, Бетесда, Мэриленд, США
RPMI средний 1640 (1 шт.)	Gibco, Пейсли, Великобритания	52400-025
Sytox green 5 мМ Непроницаемый краситель для ДНК	Gibco, Пейсли, Великобритания	57020
Трипановая синяя морилка 0,4%	Sigma Aldrich, Германия	17942E
96-луночный, черный, плоскодонный, планшет, обработанный культурой тканей	Фалькон, штат Нью-Йорк, США	353219