Выделение липидов из нейтрофилов, полученных из крови человека, путем двухфазного разделения

Аннотация

Источник: Brogden, G., et al. методы изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующего образования нейтрофильных внеклеточных ловушек. J. Vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует выделение липидов из нейтрофилов человека с помощью двухфазной системы растворителей с использованием метанола и хлороформа.

Протокол

1. Выделение липидов и анализ нейтрофилов, полученных из крови человека

1. Возьмите нейтрофилы и поместите их на лед.
2. На льду поместите нейтрофилы (присутствующие в растворе метанола и хлороформа) в стеклянную пробирку объемом 15 мл с завинчивающейся крышкой и уплотнением из политетрафторэтилена (ПТФЭ) и гомогенизируйте их, встряхивая в течение 1 мин. Используйте стеклянные трубки, чтобы предотвратить связывание липидов с пластиковыми поверхностями. Используйте колпачки из ПТФЭ для предотвращения загрязнения резиной/пластиком.
3. Добавьте 2 мл метанола, а через 1 минуту добавьте 1 мл хлороформа. Снова встряхните в течение 1 минуты.
4. Вращайте стеклянные трубки с RT и 50 об/мин в течение 30 минут.
5. Гранулируйте белковую фракцию, центрифугируя раствор при температуре 7 °C и 1,952 x g в течение 10 минут.
6. Осторожно сцедите надосадочную жидкость в новую стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 15 мл, оставив гранулу, содержащую белок. Храните гранулы при температуре -20 °C для дальнейшего количественного анализа.
7. Добавьте 1 мл хлороформа, подождите 1 минуту, добавьте 1 мл дважды дистиллированной воды и переверните стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой с образцом на 30 секунд.
8. Центрифугируйте при температуре 7 °C и 1,952 x g в течение 10 мин и отбраковывайте верхнюю фазу, вплоть до мутного слоя, но не включая его.
9. При необходимости выполните необязательный этап дальнейшей очистки, повторив шаг 1.1.8.
10. Высушите образцы в вакуумном концентраторе при температуре 60 °C и храните их при температуре -20 °C до тех пор, пока не потребуется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Шприц 10 мкл	Гамильтон	701 NR 10 μл
Канюля 26G	Браун	4657683
хлороформ	Карл Рот	7331.1 Телефон 7331.1
метанол	Карл Рот	7342.1 Материал 7342.1
Вода	Карл Рот	3255.1 Кабельный терминал No 3255.1	Не содержит эндотоксинов