Анализ высвобождения лактатдегидрогеназы для выявления инфекции Cryptococcus neoformans в макрофагах

Аннотация

Источник: Ball, B., et al. Рабочий процесс количественной протеомики без меток для взаимодействий хозяина и патогена, основанных на открытиях. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем анализ цитотоксичности для оценки инфекции Cryptococcus neoformans, патогенного грибка, в макрофагах. Цитотоксичность определяется высвобождением фермента цитоплазматической лактатдегидрогеназы в результате лизиса макрофагов, вызванного инфекцией Cryptococcus neoformans.

Протокол

1. Проверка заражения

ПРИМЕЧАНИЕ: Используя анализ цитотоксичности, можно измерить уровень инфицирования. В следующем протоколе будет рассмотрено применение цитотоксичного продукта для измерения высвобождения ЛДГ (лактатдегидрогеназы). Также можно использовать другие продукты цитотоксичности

1. Препарат C. neoformans для инфицирования клеток макрофагов
   1. Подготовка грибковых клеток
      1. Используя глицериновый материал, нанесите штамм дикого типа C. neoformans (H99) на агаровую пластину пептона декстрозы дрожжевого экстракта (YPD) для выделения одиночных колоний.
      2. Инкубировать в течение ночи в течение 16 часов при температуре 37 °C в статическом инкубаторе.
      3. Выберите одну колонию дикого типа штамма C. neoformans и культуру в 5 мл бульона YPD в пробирке объемом 10 мл с неплотно закрытой крышкой. Выполняйте в четверном удлинении.
      4. Инкубировать в течение ночи в течение 16 часов при 37 °C в встряхивающем инкубаторе при 200 об/мин.
      5. На следующий день субкультуры каждую ночную культуру разводят в соотношении 1:100 до 3 мл бульона YPD.
      6. Измерьте значения оптической плотности (наружный диаметр_{600 нм)} культуры грибов, чтобы определить среднюю фазу логарифма. В зависимости от спектрофотометра, штамм дикого типа C. neoformans достигает среднелогической фазы, как правило, после 6-8-часовой инкубации в YPD с общими значениями OD_{600 нм} в диапазоне от 1,0 до 1,5.
      7. Как только клетки достигнут средней логарифмической фазы, возьмите аликвоту 10 мкл суспензии грибковых клеток в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и разведите 1:100 в стерильном 1x фосфатно-солевом буфере (PBS). Посчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
      8. Соберите и центрифугируйте ячейки при давлении 1500 x g в течение 10 минут, аккуратно промойте гранулу стерильной PBS комнатной температуры и повторите в общей сложности три промывки.
      9. Ресуспендируйте клетки в среде для культивирования клеток, не содержащей антибиотиков, для достижения концентрации 1,2 x 10⁸ клеток/мл.
   2. Подготовка клеток макрофагов
      1. Визуализируйте каждую лунку в 6-луночном планшете, чтобы убедиться, что клетки достигли 70-80% слияния. В качестве альтернативы клетки могут быть измерены для получения примерно 1,2 x 10⁶ макрофагальных клеток на лунку.
      2. Подогрейте среду с добавлением антибиотиков до 37 °C перед культивированием клеток. Убедитесь, что рабочая среда стерилизована перед культивированием клеток. Визуализируйте клетки с помощью светового микроскопа, чтобы убедиться, что клетки прилипли и здоровы.
      3. Удалите среду для культивирования клеток из чашки с помощью серологической пипетки или вакуумного аспиратора.
      4. Аккуратно добавьте 5-7 мл стерильного PBS комнатной температуры PBS (фосфатно-солевой буфер) в чашку размером 60 x 15 мм.
      5. Аккуратно наклоните посуду, чтобы вымыть прилипшие клетки.
   3. Совместное культивирование клеток C. neoformans и макрофагов
      1. Добавьте 1 мл ресуспендированных клеток C. neoformans в 4 лунки, содержащие макрофагальные клетки.
         заметка: Количество необходимых пластин должно быть рассчитано до начала эксперимента. Добавьте 1 мл среды, не содержащей антибиотиков, в пустые лунки.
      2. Дайте клеткам инкубироваться при 37 °C с 5%_CO2 в течение 3 ч.
      3. Извлеките питательную среду из планшета с помощью серологической пипетки или вакуумного аспиратора.
      4. Аккуратно добавьте 1 мл стерильного PBS комнатной температуры.
      5. Осторожно наклоните пластину, чтобы промыть неприкрепленные или нефагоцитированные внеклеточные клетки C. neoformans.
      6. Добавьте по 1 мл среды, не содержащей антибиотиков, в каждую лунку в 6-луночном планшете.
      7. Инкубируйте клетки при 37 °C с 5%_CO2.
   4. В выбранные моменты времени (например, 1, 3, 6, 12 и 24 часа) соберите надосадочную жидкость для измерения выброса ЛДГ в соответствии с инструкциями производителя.
   5. В то же время неинфицированные клетки макрофагов будут лизироваться до определенного значения для достижения максимальной цитотоксичности.
   6. Рассчитать цитотоксичность можно следующим образом:
      

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 мМ Tris-HCl, pH 8,5	Научный центр Фишера	БП152-1	Поддерживать при температуре 4°C
Тарелка 60 x 15 мм, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
6-луночный планшет для культивирования клеток	ThermoFisher Scientific	140675
Конические соколиные пробирки (15 мл)	Научный центр Фишера	Тел.: 05-539-12
Автоматизированный счетчик ячеек Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Не обязательно, в качестве альтернативы можно использовать гемоцитометр.
CytoTox 96 Анализ нерадиоактивной цитотоксичности	Компания Promega	Г1780
DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Нагрейте и инактивируйте путем инкубации при температуре 60°C в течение 30 минут. Приготовьте 50 мл аликвот и мгновенно заморозьте. Размораживание перед подготовкой среды
Гемоцитометр	ВВР	15170-208
ХЕПЕС	Сигма Олдрич	Н3375	Приготовьте 40 мМ HEPES/8 М мочевины в растворе бестарного склада, мгновенной заморозке, храните при -20°C до использования. Выбрасывайте после каждого использования (не замораживайте-не размораживайте повторно).
L-глютамин	ThermoFisher Scientific	25030081	Может быть аликвотным и замороженным для хранения. Разморозьте перед подготовкой среды.
Микроцентрифуга	Эппендорф	13864457
Пенициллин: Стрептомицин 10к/10к	ВВР	CA12001-692	Может быть аликвотным и замороженным для хранения. Разморозьте перед подготовкой среды.
Фосфатно-солевой буфер	ВВР	CA12001-676	Покупка не требуется. PBS также можно приготовить, но перед использованием необходимо провести стерильную фильтрацию.
Пипетка, одноразовая серологическая (10 мл)	Научный центр Фишера	13-678-11Э
Пипетка, одноразовая серологическая (25 мл) Basix	Научный центр Фишера	14955235
Смесь трипсина/протеазы Lys-C, степень MS	прокалывать	А40007	Поддерживать при температуре -20 °C.
мочевина	Сигма Олдрич	У1250-1КГ	Приготовьте 40 мМ HEPES/8 М мочевины в растворе бестарного склада, мгновенной заморозке, храните при -20 °C до использования. Выбрасывайте после каждого использования (не замораживайте-не размораживайте повторно).
Отвар пептона декстрозы с экстрактом дрожжей	BD Difco	БМ20