Извлечение лизата клетки-хозяина из инфицированных клеток-хозяев, культивируемых в проницаемой мембранной системе

Аннотация

Источник: Flaherty, R. A., et al. Реализация системы инфицирования на основе проницаемой мембранной вставки для изучения воздействия секретируемых бактериальных токсинов на клетки хозяина млекопитающих. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует систему проницаемых мембранных вставок для исследования воздействия бактериальных токсинов на клетки хозяина контролируемым и изолированным образом. Этот подход позволяет селективно подвергать клетки воздействию токсинов, сохраняя при этом физическое разделение, которое имитирует естественное взаимодействие хозяина и патогена.

Протокол

1. Бактериальная культура

1. Получение изогенных мутантных штаммов для использования для изучения специфического секретируемого фактора, представляющего интерес.
   заметка: В GASM1T1 5448 штаммов стрептококка, использованных для этих экспериментов, были WT GAS', мутант с дефицитом sagAΔ cat SLS (сокращенно в тексте ΔsagA) и штамм с дополнением sagA (сокращенно в тексте ΔsagA+sagA).
2. Готовьте в течение ночи жидкие культуры интересующих штаммов бактерий. Выращивайте штаммы GAS M1T1 5448 в -10 мл бульона Тодда-Хьюитта при температуре 37°C в течение 16-20 часов перед заражением клеток человека.
3. Центрифуга для ночных бактериальных культур (2,400 rcf в течение 10 мин) и ресуспендирование в свежей бактериальной среде.
   заметка: Ресуспендирование в том же объеме, в котором выращивались ночные культуры (5-10 мл), как правило, дает желаемую начальную оптическую плотность.
4. Нормализуйте бактериальные культуры до равных исходных концентраций путем разбавления повторно суспендированных культур в дополнительной бактериальной среде до тех пор, пока не будет получена та же оптическая плотность при длине волны 600 нм (OD600) для всех тестируемых штаммов (для удобства рекомендуется OD600 приблизительно 1,0).
   заметка: В этих исследованиях бактериальные культуры стационарной фазы использовались для инфицирования клеток хозяина сразу после нормализации. Однако, поскольку некоторые штаммы бактерий выходят из стационарной фазы несинхронно, может быть более целесообразным начинать инфекцию хозяина с культур логарифмической фазы, если будет обнаружено, что это имеет место для интересующих штаммов.
5. Перед дальнейшим анализом проведите анализ подсчета колоний, чтобы определить колониеобразующие единицы (КОЕ) на миллилитр, присутствующие в исходных культурах, чтобы можно было определить множественность инфекции (MOI), или соотношение бактерий на клетку-хозяина.
   1. Приготовьте 1 мл серийных разведений бактериальных культур, которые были нормализованы до желаемой оптической плотности в фосфатно-солевом буфере (PBS) или соответствующей бактериальной среде для роста (в этих исследованиях использовался бульон Тодда-Хьюитта). Приготовьте разведения в диапазоне от ^10-1 до 10-6, чтобы получить хотя бы один набор агаровых пластин с счетными колониями (30-300 колоний). Выполнять все разведения в трех экземплярах.
   2. Перенесите 100 мкл каждого серийного разведения на агаровый планшет, содержащий среду, соответствующую анализируемому виду бактерий.
      заметка: В этих исследованиях использовался агар Тодда-Хьюитта.
   3. С помощью стеклянного или пластикового разбрасывателя бактерий равномерно распределите аликвоту объемом 100 мкл по всей поверхности агаровой пластины и продолжайте распределять до тех пор, пока жидкость не впитается в агар. Выполнять под огнем с использованием стерильной техники.
   4. Инкубируйте агаровые пластины при температуре 37°C в течение ночи или до тех пор, пока не появятся счетные колонии.
   5. Подсчитайте колонии, которые растут на каждой пластине, и рассчитайте КОЕ/мл в исходной культуре по следующей формуле: количество колоний x обратное объему серийного разведения/объема культуры в миллилитрах.
      например, (200 колоний x 1/^10-5 разведение) / 0,1 мл с покрытием = 2,0 x 10⁸ КОЕ/мл

2. Культура клеток хозяина

1. Получите подходящую клеточную линию-хозяина для желаемых анализов.
   заметка: Для этих исследований использовались эпителиальные кератиноциты человека HaCaT29, любезный подарок от В. Низета.
   1. Поддерживайте клетки HaCaT в 100 мм культуральных чашках в модифицированной среде Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) с помощью 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS). Инкубировать при 37°C с 5%_CO2.

3. Инфицирование клеток хозяина с помощью системы вставок с проницаемой мембраной

1. Поместите клетки в соответствующие чашки для культуры тканей и дайте им расти до тех пор, пока они не достигнут 90% конфлюенции.
   Примечание: Клетки HaCaT, используемые в этих исследованиях, обычно достигают слияния в течение 2-3 дней после осаждения.
   1. Для сбора лизата (например, анализ сигналов и анализ определения аденозинтрифосфата (АТФ)) пластинчатые клетки HaCaT в 6 луночных чашках с плотностью посева примерно 3 x 10⁵ клеток/лунку.
   2. Для экспериментов по иммунофлуоресцентной визуализации пластинчатые клетки на стерильном стекле помещаются в пределах 6 луночных чашек с плотностью затравки примерно 3 x 10⁵ клеток/лунку.
   3. Для анализа мембранной пермеабилизации гомодимера этидия и высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) пластинчатые клетки HaCaT в 24 луночных чашках с плотностью посева примерно 5 x 10⁴ клеток/лунку.
2. Непосредственно перед обработкой промойте камеры 1x стерильным PBS.
3. Нанесите на клетки свежую питательную среду. При описанных здесь условиях применяйте 2 мл среды на лунку для 6-луночных планшетов или 0,5 мл среды на лунку для 24-луночных планшетов. Если тестируются фармакологические методы лечения, смешайте со свежей средой и применяйте на этом этапе.
   заметка: Для некоторых анализов могут потребоваться альтернативные среды. Например, поскольку феноловый красный и высокие концентрации в сыворотке влияют на анализ высвобождения ЛДГ, для этих экспериментов использовали безфеноловый красный DMEM, дополненный 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) (w/v), 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия.
4. После применения свежей среды осторожно поместите в каждую лунку стерильную мембранную вставку размером 0,4 мкм. Выполните этот шаг в колпаке с ламинарным потоком и с помощью стерильных щипцов перенесите проницаемую мембранную вставку в каждую лунку.
5. Нанесите свежую питательную среду для клеточных культур в верхнюю камеру каждой лунки в соответствии с инструкциями производителя. При описанных здесь условиях применяйте 1 мл среды на лунку для 6-луночных планшетов или 0,1 мл среды на лунку для 24-луночных планшетов.
6. Нанесите соответствующий объем нормализованных бактериальных культур (см. раздел 1) на верхнюю камеру системы ввода проницаемой мембраны. Используйте бактериальную среду для неинфицированного контрольного лечения. Для получения описанных здесь результатов добавьте 25 μл нормализованных культур в камеру для 24 луночных планшетов и 100 μл культур на камеру для 6 луночных планшетов.
   Примечание: В этих исследованиях дикий тип или мутантный GAS применялся к клеткам-хозяевам при MOI 10. MOI рассчитывали на основе итогового количества эукариотических клеток (например, 2 x 10⁶ клеток/лунку) таким образом, чтобы в начале периода инфекции было добавлено в 10 раз больше бактерий на клетку-хозяина (например, 2 x 10⁷ КОЕ на лунку). Соответствующий MOI будет варьироваться в зависимости от различных видов бактерий и желаемых последующих анализов.
   Примечание: В дополнение к использованию бактериальной среды для неинфицированных средств контроля, другие полезные средства контроля для определенных применений этого метода могут включать термически убитые бактерии или отработанную бактериальную среду для сравнения.
7. Инкубируйте инфицированные клетки при 37 °C с 5%_CO2.

4. Сбор образцов

1. Чтобы собрать питательную среду для клеточных культур, лизаты клеток хозяина или стеклянные покровные стекла с интактными клетками для последующего анализа, начните с осторожного удаления проницаемой мембранной вставки стерильными щипцами.
2. Для оценки лизатов клеток хозяина:
   1. Аккуратно аспирируйте среду над монослоем клеток-хозяев. Не нарушайте монослой, так как это может привести к потере образца.
   2. Промойте клетки один раз 1x PBS.
   3. Мягко аспирируйте PBS. Немедленно нанесите соответствующий объем ледяного буфера для лизиса для достижения желаемой концентрации белка и инкубируйте образцы на льду в течение 15 минут. Внесите от 200 мкл до 350 мкл лизисного буфера в лунку каждого 6-луночного планшета для достижения концентрации белка от 0,5 до 1,5 мг/мл.
      Примечание: Буфер для лизиса, использованный в этих исследованиях, состоял из деионизированной воды, 1% (v/v) заменителя Nonidet P40, коктейля ингибиторов фосфатазы и коктейля ингибиторов протеазы. Конкретные реагенты перечислены в разделе «Материалы и оборудование».
   4. С помощью скребка для клеток отсоедините клетки от поверхности планшета каждой лунки и наберите все содержимое каждой лунки пипеткой в пробирку объемом 1,5 мл.
   5. Центрифугируйте образцы при 14 000 rcf в течение 20 минут при 4°C.
   6. Чтобы оценить содержание растворимых лизатных компонентов, удалите надосадочную жидкость в свежую пробирку и храните при температуре -20°C или используйте немедленно.
   7. Чтобы оценить ядерные или другие нерастворимые компоненты лизата, зарезервируйте таблетку и храните ее при температуре -20°C или используйте немедленно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Эпителиальные кератиноциты человека HaCaT			Подарок от лаборатории Виктора Низета.
Модифицированная орлиная среда Дульбекко (DMEM)	Технологии Life	11995-073	Используйте подходящие среды для интересующей клеточной линии.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Биозапад	С162Н	Используйте соответствующие добавки для клеточной линии, представляющей интерес.
Чашки для культивирования тканей 10 см	Нунк	150350 (Английский	Подойдут и другие бренды.
6-луночные чашки для культивирования тканей	CytoOne	СС7682-7506	Другие бренды подходят, но должны быть совместимы со вставкой Corning.
Вкладыши Transwell 0,4 мкм с коллагеновым покрытием (6 лунок)	Корнинг	No 3540
Вкладыши Transwell 0,4 мкм с коллагеновым покрытием (24 лунки)	Корнинг	No 3595
Скребки для ячеек	Фишербранд	Тел.: 08-100-241	Они необходимы только для сбора клеточных лизатов.
Заменитель Nonidet P40	сигма	74385-1Л	Другие поставщики подойдут.

)